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一、基本原理

Western Blot 即蛋白免疫印跡，是等量上樣的蛋白樣品通過電泳按分子量分離蛋白質(zhì)、再轉(zhuǎn)移到合適的膜上，然后通過特異性抗體對膜上的目的蛋白或特定位點修飾進(jìn)行結(jié)合和識別，經(jīng)過抗體偶聯(lián)的顯色或顯影系統(tǒng)獲得條帶結(jié)果，通過分析條帶位置和深度來分析目的蛋白或特定位點修飾的水平。

二、步驟

（一）由蛋白樣品制備；制膠、上樣、電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉、抗體孵育；曝光五個步驟組成，其簡要流程如下：

詳細(xì)實驗步驟：

1.蛋白樣品制備

1.1蛋白樣品制備選擇合適的裂解液

根據(jù)蛋白性質(zhì)不同，選擇裂解液也不同，常用產(chǎn)品名稱：①RIPA裂解液②NP-40裂解液③SDS裂解液

區(qū)別：   

 1.2蛋白濃度測定（BCA法）

①配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品

取0.8mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管（20mgBSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，充分溶解后，配置成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。

取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS或去離子水稀釋至終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。   

②繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）

將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板中，加稀釋液補(bǔ)足到20μL 。加適當(dāng)體積樣品到96孔板孔中，如果樣本不足20μL,需加稀釋液補(bǔ)足到20μL。注意記錄樣品體積。

③配制BCA顯色液

根據(jù)樣品數(shù)量, 配制BCA 工作液，按50體積 BCA 試劑 A 加入1體積 BCA 試劑 B (50:1）配置適量 BCA 工作液，充分混勻。BCA 工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。

④酶標(biāo)儀檢測

向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色液200 μL，37℃放置20-30min。用酶標(biāo)儀測定A562或540-595nm之間的其他波長吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

⑤計算

根據(jù)繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線及所測樣品的吸光值，計算出樣品實際蛋白濃度。

1.3蛋白變性

按照體積，加入Loading Buffer 并混勻，95℃加熱變性10min，置于-20℃冰箱儲存。

1.4本實驗室貼壁細(xì)胞提蛋白步驟（蛋白提取試劑盒：invent Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells and Tissues SD-001/SD-002）此步驟僅供參考，具體以自己所用試劑說明書為準(zhǔn)。   

①樣品間數(shù)量保持相對一致的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入SD-001，500μl，冰上充分裂解10min，刮取細(xì)胞裂解液。

②移入預(yù)冷的柱子中，12000rmp,離心30S。

③棄去柱子，將蛋白置于冰上。

④進(jìn)行蛋白濃度測定，BCA法，詳細(xì)步驟見上文（本實驗室所用試劑盒：碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒。具體以自己所用試劑說明書為準(zhǔn)。）

⑤按照提取蛋白的體積，加入適量Loading Buffer 混勻，開水煮10min，置于-20℃冰箱儲存。

2. 制膠、上樣、電泳

2.1制膠

2.1.1濃縮膠、分離膠濃度的選擇

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，凝膠由兩種不同的凝膠層組成，上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩沖液pH6.7，膠濃度通常為5%；分離膠為小孔膠，緩沖液pH8.9，分離膠濃度需要根據(jù)蛋白分子量大小，選擇不同濃度的分離膠用于實驗。

2.1.2本實驗室制膠步驟（以Servicebio 10%PAGE彩色凝膠超快速配置試劑盒為例）此步驟僅供參考，具體以自己所用試劑說明書為準(zhǔn)。

①把玻璃板洗凈晾干→對齊玻璃板(短板在前，長板在后)→放入制膠架子中，兩側(cè)夾子卡緊，下端與桌面垂直→將制膠架子放在塑料架上固定好。

②加滿超純水，檢測是否漏液(靜置幾分鐘后檢查，無漏液，倒掉，倒置晾干或用無屑紙吸干)。

③配制體系

a.取兩只50ml離心管，分別將下層膠A、B液按說明書比例倒入混勻，上層膠A、B液倒入混勻

b.先配下層膠:加入同比例的促凝劑（10%AP），混勻，用巴氏管或移液槍沿玻璃加入，加到綠帶下線即可，注意要勻速，不要產(chǎn)生氣泡。

c.加無水乙醇液封，加滿(動作輕柔，不要產(chǎn)生氣泡)，等待下層膠凝固(20-30min/離心管中剩余的是否凝/也可通過觀察，會有折線出來提醒已經(jīng)凝固)。

d.倒掉上層無水乙醇(倒置晾干或用無屑紙吸干)。

e.配制上層膠:加入同比例的促凝劑（10%AP），混勻，將剩余空間加滿(上層膠比較容易凝，加的時候要快速一點，但是不要有氣泡)，將梳子插入上層膠中(加完上層膠后立即插入，注意傾斜角度插入避免氣泡產(chǎn)生)。

f.待上層膠凝固。

④配液:    

running buffer:一包粉劑配1L超純水，用于跑膠，還可用于配好的膠板的保存。

Transfer buffer:一包粉劑配800ml超純水+200ml甲醇，用于轉(zhuǎn)膜，配好后4度預(yù)冷。

TBST:一包粉劑+2L超純水+2ml洗滌劑Tween-20，用于洗滌。

2.2上樣:

①根據(jù)分組和定量結(jié)果上樣，上樣前先加熱煮沸，然后離心

②雙手緩慢垂直拔出梳子，并將RunningBuffer倒入內(nèi)外槽中,形成閉合回路。內(nèi)槽 Running Buffer需注滿，外槽RunningBuffer沒過最低刻度線即可。

③用移液器吸取樣品，垂直上樣，將槍頭置于兩塊玻璃板之間上樣泳道的位置，輕輕插入其中（不能用力插入，擠壓玻璃板），緩慢打出樣本，待樣本全部打出時，停頓2秒再拔出槍頭，保證樣品全部加入上樣泳道。

④記得上marker

2.3電泳:

①上樣完以后，連通電泳儀電源,注意正負(fù)極連接正確（黑對黑，紅對紅）

②設(shè)定適宜的電泳參數(shù)(以10%為例，濃縮膠電泳參數(shù)為恒壓60V，30min;待樣本進(jìn)入分離膠時,可將電泳調(diào)至120V,60min)。

③當(dāng)溴酚藍(lán)到凝膠底部時，停止電泳，關(guān)閉電泳儀電源。

3.轉(zhuǎn)膜    

SDS-PAGE凝膠中的蛋白因結(jié)合SDS而帶負(fù)電荷，在電場的作用下，帶負(fù)電的蛋白會轉(zhuǎn)移到膜上。

3.1膜類型的選擇

3.2轉(zhuǎn)膜條件的選擇

3.3本實驗室轉(zhuǎn)膜步驟。此步驟僅供參考，具體以實際為準(zhǔn)。   

3.3.1準(zhǔn)備工作

a.轉(zhuǎn)膜液至少提前2h（即開始電泳后）放入﹣20℃冰箱預(yù)冷。

b.目的蛋白＞20KD選擇0.45μ m NC 膜；目的蛋白＜20KD選擇0.2μ m 的 NC 膜或0.22μ m 的 PVDF 膜，選擇完畢后將 NC 膜放在 Transfer Buffer 中浸泡備用，如使用的是 PVDF 膜需先放入甲醇中浸泡2-3min，再放入Transfer Buffer 中浸泡備用。

3.3.2轉(zhuǎn)膜

取出玻板中的凝膠，在夾板上依次放一塊黑色海綿墊、兩張濾紙、凝膠、NC 膜、兩張濾紙、一塊黑色海綿墊（"三明治"結(jié)構(gòu)），將轉(zhuǎn)好的膜放在轉(zhuǎn)膜槽，再放進(jìn)電泳儀中的時候黑板對黑面，白板對紅面，其中電泳儀內(nèi)放一塊冰盒，將電泳儀置到冰盆內(nèi)，倒?jié)MTransfer buffer，調(diào)到恒A 300mA轉(zhuǎn)膜1h:

3.4麗春紅染色（可選）

帶負(fù)電荷的麗春紅染料能夠與膜上帶正電的氨基酸發(fā)生可逆結(jié)合，以判斷轉(zhuǎn)膜效率。

轉(zhuǎn)膜后將膜用麗春紅染色，染色后將膜裁剪，保留目的條帶，用TBS 洗三遍(每次5min.80r)，以去除染色，再進(jìn)行后續(xù)膜封閉及抗體孵育。

4.封閉、抗體孵育

4.1封閉

蛋白轉(zhuǎn)膜后，膜上尚有未結(jié)合蛋白的部位，可以采用封閉液進(jìn)行封閉，以減少非特異性結(jié)合。   

4.1.1封閉液選擇

①脫脂奶粉：通常封閉液的濃度為 2.5-5% （w/v）。經(jīng)濟(jì)實惠，封閉效果較強(qiáng)；缺點：目標(biāo)蛋白是磷蛋白的話會有很多背景信號。即使目標(biāo)蛋白不是磷蛋白，因為是蛋白質(zhì)的混合物，也容易產(chǎn)生較高的背景信號。

②牛血清白蛋白(BSA)：是從牛血清中提純之后的一種球蛋白，通常含有BSA的封閉液的濃度為2-5%（w/v）。缺點：價格高，提純過程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，這些蛋白都可以和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，會增加非特異性背景信號。

③商品化封閉液：通常含有提純過的蛋白，里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封閉液中難以避免的成分。每個商品化封閉液都有自己的Protocol，封閉時間很快。

4.1.2本實驗室封閉步驟

將膜取出，放入合適的孵育槽中，快速封閉液（ NCM Bioth NcmBlot Blocking Buffer 快速封閉液）封閉30-60min，用TBST洗三遍(每次5min.80r)

4.2抗體孵育

一抗識別膜上蛋白或修飾性抗原表位，二抗識別一抗恒定區(qū)從而與一抗結(jié)合，最終通過二抗攜帶的熒光或酶顯色信號，達(dá)到對樣本中目的蛋白進(jìn)行檢測的目的。一抗孵育推薦4℃過夜，可以提高抗體結(jié)合效率，并有助于降低背景；二抗一般為室溫孵育。

4.2.1內(nèi)參選擇    

   胞漿和全細(xì)胞蛋白：GAPDH（37 KD），β-actin（43 KD），Tubulin（55 KD）

   胞核蛋白：PCNA（29 KD），Histone H3（17 KD）

   核膜蛋白：lamin B（66 KD）

   線粒體蛋白：COX IV（17 KD），VDAC1（30 KD）  

4.2.2單克隆抗體和多克隆抗體選擇

抗體分單克隆抗體（monoclonal antibody, MAb）和多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）。

單克隆抗體是只能與特定的、單一抗原結(jié)合的抗體，而多克隆抗體是能與一種以上抗原結(jié)合的抗體。單克隆抗體特異性明顯強(qiáng)于多克隆抗體。在WB實驗中使用單克隆抗體檢測目的蛋白，多呈單一的、清晰條帶，實驗結(jié)果良好；而使用多克隆抗體可能導(dǎo)致多條帶或條帶不清晰，實驗結(jié)果質(zhì)量欠佳。

4.2.3抗體種屬選擇

①目標(biāo)蛋白的種屬：首先確定要檢測的目標(biāo)蛋白所屬的物種。如果樣品來自人類，那么選擇來自其他物種的抗體，如小鼠、兔子或羊等，因為這些抗體通常對人類蛋白有較高的特異性。

②一抗種屬：選擇與樣品來源不同種屬的一級抗體。例如，如果樣品來自人類，那么可以選擇小鼠或兔子的抗體作為一抗。這種不同種屬的抗體可以識別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。

③二抗種屬：選擇與一抗相應(yīng)種屬的二抗。二抗是與一抗結(jié)合的抗體，其可被用于探測和檢測一抗。通常情況下，二抗是標(biāo)記有較容易檢測的熒光染料或酶的抗體。   

④物種交叉反應(yīng)：在選擇抗體時要注意潛在的物種交叉反應(yīng)。一些抗體可能對多個物種的蛋白具有較高的交叉反應(yīng)性，這可能會導(dǎo)致誤解或干擾。確保驗證抗體的特異性，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)以了解抗體在特定物種中的應(yīng)用情況。

⑤每個實驗都是獨特的，對于不同的目標(biāo)蛋白和實驗條件，可能需要進(jìn)行不同的選擇和優(yōu)化。因此，在選擇抗體種屬時，請參考相關(guān)文獻(xiàn)、抗體供應(yīng)商的指南，并根據(jù)自己的實驗需求進(jìn)行驗證和優(yōu)化。

4.2.4一抗孵育

按抗體說明書比例，分別將一抗和actin抗體用一抗稀釋液配好，分別將膜浸泡到配好的抗體中，覆蓋搖勻(40r,1h)4°冰箱敷過夜;過夜后將抗體回收，膜用TBST洗三遍(每次5min,80r)

4.2.5二抗孵育

二抗抗體按抗體說明書比例用二抗稀釋液配好，將洗好的膜置入盒內(nèi)，用二抗覆蓋搖勻(40r1h)，后將抗體回收，膜用TBST洗三遍(每次5min.80r)

5.曝光

5.1原理

WB 檢測中，二抗偶聯(lián)的最常見的酶是 HRP （辣根過氧化物酶），以 ECL 為底物進(jìn)行發(fā)光檢測。

5.2本實驗室發(fā)光步驟

以ECL Western Blot kit超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 (西安壯志科技有限公司) 及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) Tanon-5200Multi為例。此步驟僅供參考，具體以自己買的試劑說明書為準(zhǔn)。   

①根據(jù)膜的大小，按照1:1將A液、B液混勻，配制成發(fā)光檢測工作液。

②將膜取出，去除膜上多余的液體，放在塑料盒中，用移液器將工作液加到膜上，來回吹吸5-8次，使其均有覆蓋。

③化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：將膜放置到成像儀內(nèi)，參考儀器說明書進(jìn)行檢測,顯影觀察結(jié)果。

三、常見問題及解決方法

（一）條帶弱或無目的條帶

（二）多條帶或非特異性條帶

（三）條帶位置異常（表觀分子量與理論不符）

（四）高背景

（五）條帶變形