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【實(shí)驗(yàn)原理】

　轉(zhuǎn)錄因子通常含有兩個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)，只有當(dāng)這兩種結(jié)構(gòu)域共同作用時才能使轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。利用此特性，可以分別使BD與AD同“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用來進(jìn)行篩選的目的蛋白稱為“誘館”蛋白，而篩到的陽性克隆稱為“獵物”蛋白。單獨(dú)的BD與AD蛋白質(zhì)游離于細(xì)胞中不同的位置而分開，不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。如果兩種蛋白X和Y可以發(fā)生相互作用，就能使BD與AD在空間上充分接近，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

一、酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。

(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。

(3) 30℃培養(yǎng)，200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。

(4) 當(dāng)菌液OD值約為0.3時，轉(zhuǎn)移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。

(5) 30℃培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。

(6) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

(7) 將底部沉淀使用已預(yù)熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細(xì)胞。

(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時。

(9) 5min室溫離心收集細(xì)胞。

(10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細(xì)胞.

(11) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。

(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細(xì)胞。

(13) 將懸重懸細(xì)胞分成2管，6000g轉(zhuǎn)速室溫離心30s。

(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，分裝為100uL每管。

二、轉(zhuǎn)化

（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。

（2）每個離心管中加入100 μL的酵母感受態(tài)細(xì)胞，500 μL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質(zhì)粒，并且將管中的混合物進(jìn)行旋渦振蕩，將其混勻。

（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。

（4）往每個離心管中加70 μL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。

（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。

（6）吸取100 μL并涂布在相應(yīng)的二缺固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，待菌長好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。

互作驗(yàn)證：

取過夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上，將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否生長與顏色變化。

【常見問題與注意事項】：

（1）檢測感受態(tài)細(xì)胞效率，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

（2）注意質(zhì)粒使用量，檢查儀器狀態(tài)。

（3）配制新鮮培養(yǎng)基，并做對照轉(zhuǎn)化，添加抑制劑，同時增設(shè)嚴(yán)格的對照組防止自激活。

（4）應(yīng)挑選大的、新鮮的菌株克隆進(jìn)行培養(yǎng)。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項服務(wù)。

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