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【實(shí)驗(yàn)原理】

應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過(guò)氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

一.固定、脫水、包埋

00001. 取組織放入4%多聚甲醛里面固定3-4小時(shí),時(shí)間根據(jù)標(biāo)本大小適當(dāng)調(diào)整。

00002. 取適當(dāng)大小組織放入包埋盒中,進(jìn)行脫水。每個(gè)染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個(gè)包埋盒。依次進(jìn)入:
75%酒精1.5小時(shí)、95%酒精1.5小時(shí)、95%酒精1小時(shí)、無(wú)水乙醇1.5小時(shí)、無(wú)水乙醇1小時(shí)、二甲苯一號(hào)0.5小時(shí)、二甲苯二號(hào)0.5小時(shí)。
打開(kāi)包埋機(jī),分別開(kāi)啟冷臺(tái),冷點(diǎn),石蠟槽,組織槽進(jìn)行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機(jī)組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機(jī)器組織槽中,然后再放入石蠟飯盒一號(hào)進(jìn)行第二遍浸蠟,然后石蠟飯盒二號(hào),進(jìn)行三次浸蠟。

00003. 選大小符合的模具,先調(diào)整機(jī)器滴蠟的速度,不宜過(guò)快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟,然后從飯盒二號(hào)中拿出浸后的包埋盒,打開(kāi)用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟后放到冷臺(tái)上冷卻。按上述步驟繼續(xù)包埋下一個(gè)蠟塊。

二.切片、制片

00001. 打開(kāi)切片機(jī),固定蠟塊(可提前4度冰箱預(yù)冷一下),調(diào)整刀片和蠟塊的距離。然后調(diào)整切片厚度,先粗切,看到完整的蠟片并且有組織后切換厚度,調(diào)整到自己想要切的厚度。用力均勻,右手搖動(dòng)切片,左手用毛筆接片。如片子打卷,可以用毛筆按著蠟片的邊緣再緩慢切,這樣可以得到相對(duì)平整的片子。

00002. 用毛筆和鑷子將片子或者帶狀片子托起,放入水槽中展片,水溫在40度左右。然后用防脫片載玻片輕輕撈起,載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部,防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然后標(biāo)注切片編號(hào)放到烤片機(jī)上烤片30分鐘。

三.組織化學(xué)染色

00001. 室溫脫蠟、水化:二甲苯一號(hào)10分鐘、二甲苯二號(hào)8分鐘、二甲苯三號(hào)8分鐘、無(wú)水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。

00002. 熱抗原修復(fù),換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復(fù)液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。

00003. 免疫組化筆畫(huà)圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫(huà)圈圍住組織,圓圈完整。

00004. 滅活內(nèi)源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過(guò)氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見(jiàn)二抗說(shuō)明書(shū)),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。

00005. 封閉非特異性位點(diǎn):甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內(nèi),室溫10分鐘。

00006. 甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內(nèi)4攝氏度過(guò)夜。(一抗?jié)舛纫?jiàn)抗體說(shuō)明書(shū),提前稀釋后分裝,并在負(fù)二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。

00007. 第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復(fù)溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。

00008. 甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。

00009. 每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。

00010. 每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來(lái)水沖洗。

00011. 蘇木素復(fù)染,1-2分鐘,細(xì)胞核變藍(lán)色即可終止,自來(lái)水或者PBS沖洗反藍(lán)(可用0.5%氨水反藍(lán))。

00012. 1%鹽酸酒精分化3秒,自來(lái)水沖洗三分鐘。

00013. 脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無(wú)水乙醇4分鐘、二甲苯一號(hào)3分鐘、二甲苯二號(hào)3分鐘。

00014. 涼干片子后滴加適量中性樹(shù)膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
顯微鏡下拍照。

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】

1、標(biāo)本固定
固定的目的是為了使蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性/外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性?，F(xiàn)在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對(duì)特殊組織有更好的效果，如苦味PLP固定液對(duì)于含糖組織保存更好，Helly固定液對(duì)于胰島和垂體效果較好等。

2、脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水，對(duì)于一些易脆的組織應(yīng)減少高濃度酒精里的停留時(shí)間，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。對(duì)組織浸蠟時(shí)，一般選用56℃-58℃熔點(diǎn)石蠟，浸蠟溫度最好不超過(guò)60℃，防止抗原的損失。包埋時(shí)應(yīng)果斷迅速，切片時(shí)注意檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，防止；蠟帶出現(xiàn)裂痕。

3、脫蠟和水化
使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)暴露抗原，方便與一抗結(jié)合。若脫蠟與水化不完全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不完全，產(chǎn)生非特異性背景著色。

4、抗原修復(fù)
由于組織在甲醛或多聚甲醛在固定中，發(fā)生蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率，常用方法通常使用高壓加熱修復(fù)，使用高壓加熱修復(fù)對(duì)修復(fù)溫度和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。另外，大家盡量使用過(guò)量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對(duì)切片造成不可逆影響。

5、標(biāo)本固定
傳統(tǒng)的免疫組化法容易受到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須對(duì)其進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶一般用3%過(guò)氧化氫滅活10min左右，用甲醇配制過(guò)氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織。

6、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽(yáng)性，一般會(huì)采用BSA、羊血清等封閉這些位點(diǎn)，封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，室溫封閉10-30min。

7、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間
不同的一抗?jié)舛?，孵育時(shí)間和溫度等對(duì)染色結(jié)果往往有較大的影響。在4℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺；而37℃反應(yīng)較快，時(shí)間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。

8、DAB顯色
檢測(cè)背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時(shí)間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)且出現(xiàn)背景著色較淺時(shí)就可以沖洗。如果DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)十分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，可能是一抗體濃度過(guò)低或者封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可以加入金屬離子來(lái)增強(qiáng)顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時(shí)間過(guò)短顏色就很深，這可能是一抗過(guò)高，需要下調(diào)抗體濃度，如果短時(shí)間內(nèi)過(guò)深

9、復(fù)染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有必要進(jìn)行復(fù)染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著色的時(shí)間可以適當(dāng)縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍(lán)。

10、封片
在封片階段我們通常是用中性樹(shù)膠來(lái)進(jìn)行，封片過(guò)程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產(chǎn)生從而對(duì)結(jié)果進(jìn)行營(yíng)影響，建議最好在通風(fēng)櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)的鏡檢。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）

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