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【實驗原理】

細胞劃痕實驗（Cell scratch assay）是通過在細胞單層上劃痕并通過延時顯微鏡定期捕獲圖像，從而研究細胞遷移運動、修復能力和細胞間相互作用的實驗室技術，基本原理是：在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合，于細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值，可對細胞的遷移能力做出判斷。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Wound healing assay)?？捎糜诳梢杂^察藥物、基因等外源因素對細胞遷移、修復和相互作用的影響。

【實驗步驟】

1. 劃線：先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；

2. 鋪板：處于對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板；細胞鋪板6w/孔，接種原則為過夜后融合率達到100%，每孔最終的培養(yǎng)基總量2mL；

3. 細胞培養(yǎng)37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

4. 劃痕：第二天用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；

5. 清洗：PBS沖洗細胞3次，除去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基；

6. 拍照：擦去6孔板背后的marker橫線劃痕。4倍鏡下進行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，加入待測樣本，設置濃度梯度，可按0，6，12，24h時間點取樣，拍照。

7. 結果分析，使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6至8條水平線，計算細胞間距離的均值或者劃痕面積均值。

8. 數(shù)據(jù)處理：

細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積

細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細胞間距離均值-t時刻細胞間距離均值)/初始細胞間距離均值

【常見問題與注意事項】

1. 劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直，有利于后續(xù)拍照分析，劃線會在拍照前擦去。

2. 細胞接種數(shù)量需根據(jù)細胞生長速度和狀態(tài)而定，接種原則為過夜后融合率達到100%，即細胞間沒有空隙，否則會影響后續(xù)拍照分析。

3. 同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時槍頭垂直，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致，一次性劃完。

4. 沖洗時要溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細胞，反復多次沖洗，盡量洗掉所有的細胞碎片。

5. 降低細胞增殖對遷移造成的假陽性結果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細胞增殖對實驗結果的影響；②一般認為24h為細胞的一個周期，在選取合適的時間點(6，12，24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細胞一個周期的時間；③如果要單純考慮細胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理1h，抑制細胞的分裂。

6. 盡量保證各個劃痕寬度一致, 人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學可以選擇culture Insert（如下圖），將細胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500um、1000um寬度的劃痕。

【交付標準】

1.  實驗報告 

2. 真實實驗結果

3. 原始圖片

4. 實驗原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。

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