轉(zhuǎn)錄調(diào)控
▼ 服務(wù)介紹
【實驗原理】
轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以控制轉(zhuǎn)錄何時發(fā)生以及產(chǎn)生多少RNA。被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的基因可被至少五種機(jī)制所調(diào)控:
特異性因子會改變RNA聚合酶對于特定啟動子或一套啟動子識別的特異性,使得RNA聚合酶更多或更少地結(jié)合到這些啟動子上(如原核轉(zhuǎn)錄中用到的σ因子)。
阻遏因子會結(jié)合到DNA鏈上的靠近或覆蓋啟動子區(qū)域的那些非編碼序列上,阻礙RNA聚合酶順利進(jìn)入此鏈,故阻礙了基因的表達(dá)。
通用轉(zhuǎn)錄因子:這些轉(zhuǎn)錄因子將RNA聚合酶安放至編碼蛋白序列的起始位置,繼而釋放聚合酶以轉(zhuǎn)錄mRNA。
激活因子增強(qiáng)RNA聚合酶與特定啟動子的相互作用,促進(jìn)基因的表達(dá)。激活因子通過增強(qiáng)RNA聚合酶對啟動子的吸引而達(dá)到此作用,這一機(jī)制是通過與RNA聚合酶亞基的相互作用或間接通過改變DNA結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)的。
增強(qiáng)子是位于DNA螺旋結(jié)構(gòu)上的一些位點,它們通過與激活因子相結(jié)合以將DNA彎曲使特定啟動子朝向起始復(fù)合物。
【實驗步驟】
第一步:提取DNA樣本
在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子和啟動子實驗之前,首先需要從細(xì)胞中提取DNA樣本。DNA提取的方法有很多種,常用的包括CTAB法、瓊脂糖法、商業(yè)DNA提取試劑盒等。選擇合適的提取方法可以保證提取到質(zhì)量較高的DNA樣本。
第二步:PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列
提取到DNA樣本后,接下來需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列。PCR是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù),通過PCR擴(kuò)增可以獲得足夠的目標(biāo)序列用于后續(xù)的實驗。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,需要設(shè)計合適的引物,控制PCR反應(yīng)條件,確保擴(kuò)增出純凈的目標(biāo)序列。
第三步:構(gòu)建啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的熒光報告基因載體
在實驗中,我們通常會將啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的片段克隆到熒光報告基因載體中,用于研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。構(gòu)建載體需要進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟,確保載體的構(gòu)建正確無誤。
第四步:轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行熒光素檢測
構(gòu)建好熒光報告基因載體后,需要將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的方法有多種,如化學(xué)轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染等。轉(zhuǎn)染后,可以通過熒光素檢測等方法來研究啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的活性,了解基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
第五步:數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀
實驗完成后,需要對實驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀??梢酝ㄟ^熒光素檢測結(jié)果來分析啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的活性,了解它們在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。同時,還可以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,比較不同實驗組之間的差異性,得出科學(xué)的結(jié)論。
【常見問題與注意事項】
1.樣本數(shù)量要合理,樣本之間的差異應(yīng)該是由實驗因素引起的;
2.滿足RNA提取的高質(zhì)量要求,并嚴(yán)格控制實驗過程中的污染問題:3.在選擇測序技術(shù)時,要充分考慮實驗?zāi)繕?biāo)、樣本特性和經(jīng)費(fèi)預(yù)算等因素;4.數(shù)據(jù)處理中的參數(shù)設(shè)置要合理,選擇合適的參考基因組和分析軟件;
5.結(jié)果解釋中要進(jìn)行生物學(xué)功能的富集分析,并進(jìn)行實驗驗證;
6.注意保留豐富度高的信息,如剪接異構(gòu)體和轉(zhuǎn)錄本等;
7.結(jié)果解釋要基于已有的生物學(xué)知識,并結(jié)合其他實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
【交付標(biāo)準(zhǔn)】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結(jié)果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數(shù)據(jù)
5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還(超過周期,不予返還)
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