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【實(shí)驗(yàn)原理】

WB實(shí)驗(yàn)是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質(zhì)樣品分離后，利用特殊虹吸或電場(chǎng)裝置印跡至固相介質(zhì)（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相對(duì)應(yīng)的第一抗體特異性結(jié)合，之后再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，最終通過(guò)底物顯色或放射自顯影來(lái)檢測(cè)特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

一、蛋白樣本提取制備

1 細(xì)胞或組織裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑
3 蛋白定量
4 電泳上樣樣品的準(zhǔn)備

二、 電泳

1 PAGE 膠的制備
2 蛋白分子量 Marker
3 陽(yáng)性對(duì)照
4 內(nèi)參對(duì)照
5 上樣與電泳

三、 轉(zhuǎn)膜與顯色（ Western Blot）

1 膠中蛋白的檢測(cè)
2 蛋白轉(zhuǎn)膜
3 膜上蛋白的檢測(cè)：麗春紅
4 膜的封閉
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 顯色

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】
一、蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，是決定 WB 成敗的關(guān)鍵步驟之一。

蛋白提取總體原則與注意事項(xiàng)包括：

1) 盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度使得集中于提取目的蛋白（通過(guò)采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）。

2) 保證蛋白處于可以溶解狀態(tài)（通過(guò)裂解液的pH 、鹽濃度、 表面活性劑、還原劑等的選擇實(shí)現(xiàn)）。

3) 提取過(guò)程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（全程保證在冰盒中低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。

4) 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過(guò)加入核酸酶或采取不同提取策略）。

5) 樣品分裝，長(zhǎng)期于-80℃中保存，避免反復(fù)凍融。

6)條帶不清晰：可能是由于抗體質(zhì)量不佳、孵育條件不當(dāng)或顯色反應(yīng)不足等原因造成?？梢試L試更換抗體、調(diào)整孵育條件或延長(zhǎng)顯色時(shí)間來(lái)解決。

7) 背景過(guò)深：可能是由于抗體濃度過(guò)高、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或顯色過(guò)度等原因?qū)е??？梢赃m當(dāng)降低抗體濃度、縮短孵育時(shí)間或減少顯色反應(yīng)時(shí)間以改善背景。

8) 非特異性結(jié)合：可能是由于樣品中存在雜質(zhì)或抗體特異性不足引起。可以通過(guò)優(yōu)化樣品處理、選擇特異性更強(qiáng)的抗體或增加洗滌次數(shù)來(lái)減少非特異性結(jié)合。

 總之，在進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備、樣品處理與電泳、轉(zhuǎn)膜與抗體孵育、顯色與結(jié)果分析以及實(shí)驗(yàn)后的處理等方面。通過(guò)遵循標(biāo)準(zhǔn)操作程序、注意細(xì)節(jié)和常見(jiàn)問(wèn)題解決方案，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，保持實(shí)驗(yàn)記錄的完整性和可追溯性對(duì)于后續(xù)分析和實(shí)驗(yàn)總結(jié)也至關(guān)重要。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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