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RNA分子能夠與其他生物分子，如蛋白質(zhì)、DNA和RNA，發(fā)生廣泛的相互作用，從而以大分子復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞及生物體中，其中，RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物是RNA存在以及發(fā)揮功能的重要形式之一。RNA pull-down是檢測與RNA（如 miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白的重要技術(shù)之一。

【技術(shù)原理】

首先標(biāo)記 RNA（如生物素探針標(biāo)記 RNA），將其與細(xì)胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，分離復(fù)合物得到蛋白質(zhì)，通過蛋白免疫印跡（western blot）或質(zhì)譜（massspectrometry）檢測蛋白。

【實(shí)驗(yàn)方法】

Step1：生物素探針標(biāo)記RNA的制備

Step2：RNA抽提

Step3：細(xì)胞裂解

Step4：磁珠預(yù)處理

Step5：RNA與磁珠結(jié)合

Step6：RNA 與蛋白相互作用

Step7：蛋白的檢測

【實(shí)驗(yàn)流程】

【常見問題】

1、RNA結(jié)合蛋白沒有結(jié)合

    可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）緩沖體系不對；（3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低。

    解決方法：（1）增加上樣蛋白量；（2）應(yīng)用低鹽體系；（3）加入交聯(lián)試劑。

2、RNA 降解

    可能原因：無核酸酶的環(huán)境被破壞，比如RNA提取過程中的試劑及材料等；體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針降解等。

     解決方法：清洗和使用新開的離心管和試劑等；RNA探針合成后，電泳檢測其長度和濃度。

3、RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠

    可能原因：結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探針用量不足等。

    解決方法：優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件、增加裂解液和蛋白上樣量的比例、適當(dāng)改變磁珠及探針用量、增加裂解液、確定生物素和鏈霉親和素效率等。

4、結(jié)合的非特異性高

    可能原因：（1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化；（2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低；（3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優(yōu)化。

    解決方法：（1）優(yōu)化孵育時間溫度鹽濃度等條件；（2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系；（3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例；（4）提高裂解液的量。

5. WB信噪比高

    可能原因：（1）陽性信號率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白沒有充分溶解。

    解決方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化學(xué)發(fā)光液；（3）用細(xì)胞裂解液預(yù)孵一抗；（4）增加樣品的量；（5）確定有沒有其他可能的結(jié)合情況；（6）增加裂解液用量。

【注意事項(xiàng)】

1、RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體中均需保證無RNase；

2、磁珠與帶標(biāo)簽的RNA要充分混合，可優(yōu)化孵育的溫度、時間以及RNA的含量等。