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【實驗原理】

原代細胞培養(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。

【實驗方法】
1)胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)
a．采用認可的方案處死嚙齒動物。
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
2)將1－2個胚胎轉移至一個小的無菌培養(yǎng)皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用PBS漂洗。
3)在無菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉移于一50ml 的無菌離心筒中, 加入40ml 0.25％的無菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動 。

4) 在溫暖的環(huán)境中或置于37 °C培養(yǎng)箱中輕輕搖動15分鐘。
5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉移至一無菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。
6)加人新鮮胰蛋白酶溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中，重復步驟4和5。
7)離心混合的細胞懸液，1200r/rain，5分鐘，棄上清。
8)用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞，按步驟7再次離心。
9)用PBS反復洗滌細胞直至上清清亮為止。

【常見問題與注意方法】

1)原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

2)要注意無菌操作。其操作要求應高于外科手術

3)整個取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右，不能過長，以確保胚胎細胞活性。

4)運用消化法時胰酶溫度應低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。

5)如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。

6)原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

7)本實驗也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應小心操作，避免污染細菌。乳鼠原代培養(yǎng)細胞的存活率不及胚胎細胞培養(yǎng)的成功率。

【交付標準】

1.  實驗報告 

2. 真實實驗結果

3. 原始圖片

4. 實驗原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。

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