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【實驗原理】

IP是利用固定在磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物上的特異性抗體對抗原進行親和純化的方法?；驹硎强乖?抗體特異性結合，檢測目的是富集分離蛋白。

Co-IP是IP的延伸，主要是用于探測兩個蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話，那么當用一種蛋白的抗體進行免疫沉淀時，另一個蛋白也會被同時沉淀下來。基本原理也是抗原-抗體特異性結合，檢測目的是蛋白間相互作用。

【實驗步驟】

1、樣品裂解-裂解液；

2、樣品的預純化-normal IgG/微珠；

3、與目標蛋白抗體共孵育-IP抗體、Normal IgG；

4、免疫共沉淀-微珠；

5、微珠清洗-裂解液；

6、洗脫；

7、WB 分析或其他分析-WB一抗、二抗。

【常見問題與注意事項】

1、高背景

A.可能原因：制備樣品中可能有不完全溶解的大的蛋白復合體。

對應解決：制備樣品后進行短暫超聲處理（3次，每次5秒鐘），離心純化，取上清進行后續(xù)實驗。

B.可能原因：洗滌不徹底。

對應解決：多次洗滌，并逐漸增加洗滌緩沖液中的NaCl和去垢劑濃度。

C.可能原因：非特異性蛋白吸附于磁珠上。

對應解決：進行預處理以防止非特異性吸附。

D.可能原因：抗體本身特異性不好。

對應解決：選擇合適的抗體，可以考慮單抗。

E.可能原因：使用了太多的抗體。

對應解決：進行條件優(yōu)化減少抗體。

F.可能原因：使用了過多的細胞或組織用于裂解。

對應解決：減少細胞或組織量，推薦使用100-500 μg細胞裂解物。

G.可能原因：抗原降解。

對應解決：保證樣品中加入了蛋白酶抑制劑，盡量使用新鮮制備的樣品。

2、無信號

A.可能原因：目的蛋白在樣本中表達量低或者不表達。

對應解決：首先對目的蛋白表達量進行檢測，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并進行預處理。

B.可能原因：細胞裂解液使用不當。

對應解決：根據(jù)實驗需要選擇，慎重考慮。

C.可能原因：目的蛋白未被洗脫。

對應解決：保證使用合適的洗脫液，保證洗脫液的強度和PH值合適。

D.可能原因：抗原降解。

對應解決：保證樣品中加入了蛋白酶抑制劑，盡量使用新鮮制備的樣品。

E.可能原因：抗體沒有很好的與微珠相互結合。

對應解決：選擇合適的微珠。

F.可能原因：抗體選擇不當或者不工作。

對應解決：利用WB對抗體進行驗證。

G.可能原因：抗體使用不足。

對應解決：查閱文獻或者說明書，并多次優(yōu)化或選擇合適的抗體使用量。

3、假陽性

假設Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽性”及對應需要設置的實驗對照如下所示：

4、免疫共沉淀實驗失敗原因

A.可能原因：樣品被蛋白酶降解。

對應解決：添加蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)；所有操作保持 4℃以下冰上操作并防止凍融。

B.可能原因：抗體濃度太低。

對應解決：調(diào)整 IP 和/或 IB 抗體濃度， 必要時設立濃度梯度，摸索最佳濃度。

C.可能原因：抗體親合力太低。

對應解決：選用適合于 IP 和/或 IB 的相應抗體。

D.可能原因：IP 抗體未與珠子結合。

對應解決：選用適合于 IP 的相應珠子， 正確保存防止變質(zhì)或干燥。

E.可能原因：Tag未暴露在融合蛋白構象的表面。

對應解決：改變 tag 融合表達部位。

F.可能原因：裂解液嚴謹度太高。

對應解決：改用低嚴謹度裂解液。

【交付標準】

1. 實驗報告 

2. 真實實驗結果

3. 原始圖片

4. 實驗原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。

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