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【實(shí)驗(yàn)原理】

宏基因組技術(shù)的核心原理是通過直接從環(huán)境樣品中提取微生物的DNA或RNA，而不是通過培養(yǎng)分離的方式來研究微生物群落的遺傳信息。其主要的實(shí)驗(yàn)過程包括:樣品采集、DNA/RNA提取、建立文庫、高通量測序等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

樣品制備：樣品制備一般由兩步組成，分別為樣品收集和DNA提取，這一步驟需要極力避免污染，盡量確保使用的所有試劑的“無菌”狀態(tài)。由于二代測序的高敏感性，在DNA文庫中即便極低的DNA含量也會被擴(kuò)增并測序，一旦引入污染菌群，就會對樣品中真實(shí)的信號產(chǎn)生覆蓋。

文庫構(gòu)建&上機(jī)測序：可以看我之前的[二代測序]和[三代測序]系列文章，根據(jù)測序平臺的選擇采用不同的建庫方案及上機(jī)測序流程。

數(shù)據(jù)分析：宏基因組流行的分析方法主要分為兩種，分別為：測序序列分類（read classification）和宏基因組組裝（metagenomic assembly）。前者為宏基因組測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中已知微生物基因組的比對，按照比對結(jié)果對reads進(jìn)行分類，并根據(jù)各微生物reads的相對豐度分析樣本中各微生物的相對種群豐度；后者為根據(jù)宏基因組測序結(jié)果，對微生物基因組數(shù)據(jù)組裝為完整的基因組序列。

【常見問題與注意事項(xiàng)】

1.宏基因組測序總DNA的提取有哪些注意事項(xiàng) ?

獲得高質(zhì)量的環(huán)境樣品總DNA是宏基因組測序能否成功的關(guān)鍵。為了提取的DNA能夠代表特定環(huán)境樣品中的微生物種類，取樣時必須嚴(yán)格遵循采樣標(biāo)準(zhǔn)，盡量避免對樣品的干擾，縮短保存和運(yùn)輸?shù)臅r間，以盡可能地保持樣品的微生物原貌。若要對功能基因簇進(jìn)行研究，在提取DNA時，既要盡量完全地抽提出樣品中的DNA，又要使獲得的DNA保持較大的片段，因此在DNA 提取時要在最大提取量和最小剪切力之間進(jìn)行折中。

2. 采用llumina高通量測序平臺進(jìn)行宏基因組測序，應(yīng)如何構(gòu)建文庫 ?從環(huán)境樣品中提取總DNA后，進(jìn)行測序文庫制備，具體步驟如下:①用物理方法將DNA隨機(jī)打斷成200~500bp的片段;②對DNA末端進(jìn)行平滑化及修復(fù)處理;③ 3'末端加“A”堿基;④ DNA兩端加上“Y”型接頭;⑤ PCR擴(kuò)增使兩端連上不同的接頭序列;⑥檢測文庫質(zhì)量。

3. 在宏基因組學(xué)研究中，功能基因簇研究的技術(shù)路線是什么?功能基因簇的研究方法是通過構(gòu)建宏基因組文庫(BAC、Fosmid、Cosmid)，用表型功能的方法篩選陽性克隆并進(jìn)行測序。具體技術(shù)路線如下

4. 如何進(jìn)行pathway分析?

5. 常用的pathway數(shù)據(jù)庫包括KEGG、Reactome、BioCyc、RegulonDB、WikiPathwans等。其中，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)共包含19個子數(shù)據(jù)庫，能對基因功能、基因組信息進(jìn)行系統(tǒng)分析，并將基因和表達(dá)作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。其子數(shù)據(jù)庫GENES中包含完整或部分的測序基因組序列;Pathway數(shù)據(jù)庫中包含基因功能信息，如膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號傳遞、代謝、細(xì)胞周期等。KEGG的另一個數(shù)據(jù)庫LIGAND中則儲存了大量的化學(xué)信息，包括化學(xué)物質(zhì)、酶、催化反應(yīng)等。另外，KEGG還提供了出色的整合代謝途徑查詢，結(jié)果中不僅包含了所有的可能代謝途徑，而且還對參與各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注釋，如氨基酸序列、PDB鏈接等。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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