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【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8 法）是基于高度水溶性的四唑鹽 WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）來(lái)進(jìn)行測(cè)定的。WST-8 在電子介體的作用下可還原生成水溶性甲瓚產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。CCK-8 是非放射性的，可在細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行靈敏的比色測(cè)定，從而計(jì)算出細(xì)胞數(shù)量。WST-8 被細(xì)胞中的脫氫酶還原而生成橙色產(chǎn)物（甲瓚），可溶于組織培養(yǎng)基中。細(xì)胞中脫氫酶產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

【實(shí)驗(yàn)方法】

a. 細(xì)胞計(jì)數(shù)方案

1)在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔）。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)先培養(yǎng)（例如 37℃，5% CO2）；

2)在平板的每個(gè)孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，注意不要將氣泡引入孔中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾 OD 值讀??；

3)在培養(yǎng)箱中將平板孵育 1-4 h；時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定；

4)使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度。

b. 細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方案

1)在 96 孔板中接種 100 μL 細(xì)胞懸液（5×103 個(gè)細(xì)胞/孔）。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24h（例如 37℃，5% CO2）；

2)在平板中加入 1-10 μL 各種濃度的待測(cè)物質(zhì)； 3. 在培養(yǎng)箱中將平板孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如 6、12、24 或 48 h）； 4. 向板的每個(gè)孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，注意不要將氣泡引入孔中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾 OD 值讀取； 5. 在培養(yǎng)箱中將平板孵育 1-4 h；時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定； 6. 使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度。

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】

1)由于 CCK-8 分析基于活細(xì)胞中脫氫酶活性的檢測(cè)，因此影響活細(xì)胞中脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使 用 CCK-8 分析確定的細(xì)胞數(shù)之間存在差異；

2)混合或重懸組分時(shí)，避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響 OD 值讀取；

3)孵育時(shí)間因孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而異。通常，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間（最多 4 h）或大量細(xì)胞（~105 個(gè)細(xì)胞/孔）；

4)如果由于長(zhǎng)期培養(yǎng)而改變了培養(yǎng)基的顏色或 pH，請(qǐng)?jiān)谔砑?CCK-8 時(shí)更換培養(yǎng)基；

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1.  實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）

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