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【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是一種將外源分子（如DNA、RNA等）導(dǎo)入真核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因治療、基因功能研究等領(lǐng)域。本文將詳細(xì)介紹五種主要的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法、電穿孔法、磷酸鈣法及化學(xué)介導(dǎo)法。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

細(xì)胞傳代

(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。

(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘（37。C，5%CO2）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。

(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開(kāi)。

(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

（1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

（2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

（5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。

（6）吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。

（7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

（8）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)。

第二次細(xì)胞傳代

（1） 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

（2） 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)皿中。

（3） 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。

篩選

轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選

1．確定抗生素作用的最佳濃度：

不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn)，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的最低作用濃度。

（1） 提前24 小時(shí)在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞8 孔，接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

（2） 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。

（3）培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使用篩選濃度的一半.

2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。

3．轉(zhuǎn)染72 小時(shí)后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。

（1） 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24 孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中,長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

（2） 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來(lái)后做連續(xù)的10 倍稀釋（10-2—10-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96 孔板中培養(yǎng)，7-10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆。

4. ELISA 或Western blot 檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】

核酸質(zhì)量

DNA: 內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降，特別是對(duì)內(nèi)毒素敏感細(xì)胞比如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞或者想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和最低的細(xì)胞毒性，因此最好選擇內(nèi)毒素含量較低的質(zhì)粒抽提試劑盒。

siRNA: 需合理的計(jì)算siRNA的濃度，過(guò)多的siRNA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡。

 細(xì)胞質(zhì)量

細(xì)胞密度：不同的轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí)，需要根據(jù)說(shuō)明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

細(xì)胞狀態(tài)：不同細(xì)胞使用不同的培養(yǎng)基，血清和其他添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要細(xì)胞保持良好的狀態(tài)，通常在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這能夠提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。除此之外，要保證避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。

轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染試劑

根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及底物選擇適合的轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染試劑。理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染應(yīng)該是轉(zhuǎn)染效率高；毒性低；方法簡(jiǎn)單；省時(shí)省力。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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