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【實驗原理】

通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞并整合到其染色體中，并隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞，最后用載體中所含抗性基因進行篩選。

【實驗步驟】

第一步：篩選濃度測定，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；

第二步：進行細胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應達到60%~80% 覆蓋；

第三步：進行細胞轉(zhuǎn)染

第四步：利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結果。

方法二：應用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的最優(yōu)方式。

第一步：將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，

第二步：使用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。

第三步：用病毒轉(zhuǎn)染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細胞的病毒量。

第四步：后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細胞株。

【常見問題與注意事項】

1、篩選前的準備

篩選前我們需要確定藥物篩選的相關濃度。對于不同的細胞來說，對藥物的敏感度是各不相同的，需要在細胞能夠承受的濃度范圍內(nèi)，否則，很容易造成細胞表達低甚至死亡的情況,

2、篩選過程中的注意事項

司一般在72小時;篩選時間:一般在轉(zhuǎn)染后48小時后進行，而對于慢病毒來說加藥時

包的變化情況;空白對照:在加藥篩選時，需要提前設置好空白對照，全程對比細

換液操作:當細胞死亡達到一定的程度后，需要及時換液，以避避免,害物質(zhì)造成細胞的死亡,3、克隆篩選過程中的注意事項

在進行單克隆篩選的時候，如果有熒光標記，則盡量選擇那些帶有光較強的細胞;如果質(zhì)粒不帶熒光標記，則只能進行盲挑。當然了，無論是否帶有熒光標記，都需要對其進行驗證，而且盡量多挑幾個來進行克隆，以保證成功率。

【交付標準】

1. 實驗報告 

2. 真實實驗結果

3. 原始圖片

4. 實驗原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。

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