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【實(shí)驗(yàn)原理】

EDU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替T滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于EDU與Apollo?熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性，通過(guò)檢測(cè)EDU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。EDU檢測(cè)方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確。EDU檢測(cè)染料在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。

【實(shí)驗(yàn)方法】

Step1: 細(xì)胞預(yù)處理：按實(shí)驗(yàn)設(shè)置準(zhǔn)備處理細(xì)胞。

Step2: EDU標(biāo)記：將EDU工作液與培養(yǎng)基1:1混合，加入待檢樣品中，置于37℃飽和濕度、含5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間。

Step3: 細(xì)胞固定：EDU標(biāo)記完成后，用4%的多聚甲醛室溫固定15-20min。

Step4: 細(xì)胞通透：細(xì)胞固定完成后，用0.3%的TritonX-100室溫通透10-15min。

Step5: EDU檢測(cè)：加Click反應(yīng)液室溫避光孵育至鏡下看到熒光。

Step6: Hoechst33442染色：室溫避光孵育10min。

Step7: 結(jié)果分析：圖像獲取及結(jié)果分析。

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】

1、EDU的濃度與孵育時(shí)間有關(guān)，短時(shí)間（小于4h）宜采用高濃度（20-50μM），長(zhǎng)時(shí)間（大于24h）宜采用低濃度（1-10μM）

2、EDU孵育時(shí)間取決于細(xì)胞周期，一般為細(xì)胞周期的1/10至1/5，但大多數(shù)細(xì)胞系均可采用4h-6h孵育時(shí)間。

3、EDU反應(yīng)液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，孵育時(shí)間一般約為室溫30min-2h。

4、貼壁細(xì)胞宜采用熒光檢測(cè)方式，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、高內(nèi)涵篩選儀檢測(cè)。懸浮細(xì)胞可用涂片方式熒光檢測(cè)，亦可采用流式細(xì)胞儀分析，流式細(xì)胞儀需要具備相應(yīng)熒光通道

5、染色完成后立即進(jìn)行檢測(cè)；如果條件限制，請(qǐng)避光4℃濕潤(rùn)保存待測(cè)，但不應(yīng)超過(guò)3天，若為細(xì)胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片后4℃保存及進(jìn)行檢測(cè)。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）