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WB實(shí)驗(yàn)原理

WB experimental principle

免疫印跡（Immunoblotting）又稱為蛋白質(zhì)印跡（Western Blot，WB），是一種綜合性的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中的蛋白表達(dá)水平。

這項(xiàng)技術(shù)利用待檢測(cè)蛋白與抗體的特異性結(jié)合，測(cè)定生物樣本中的蛋白水平，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用并得到公認(rèn)。

目前，WB技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。WB實(shí)驗(yàn)一般分為SDS-PAGE樣本制備、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及免疫檢測(cè)等步驟。

WB標(biāo)準(zhǔn)流程：樣本制備→凝膠上樣、電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→抗體孵育→顯影

WB實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備階段

實(shí)驗(yàn)前需要了解重要信息

實(shí)驗(yàn)開始前一定要做的事情，是對(duì)所研究的目的蛋白在待測(cè)樣本中的表達(dá)水平、蛋白大小、翻譯后修飾等背景信息進(jìn)行深入的了解，同時(shí)也需要設(shè)置嚴(yán)格的陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣本。這將有助于在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)進(jìn)行排查分析。

通常我們會(huì)參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行樣本的選擇，下面列舉幾個(gè)常見數(shù)據(jù)庫(kù)：

該蛋白在什么組織中表達(dá)？

1）網(wǎng)址：www.biogps.org

通過mRNA表達(dá)水平給您參考估計(jì)不同樣本中目的蛋白的表達(dá)水平；樣本種屬可以選擇人、小鼠、大鼠等。還可以鏈接其他的數(shù)據(jù)庫(kù)。

2）網(wǎng)址：www.proteinatlas.org

簡(jiǎn)稱HPA數(shù)據(jù)庫(kù)，提供人類蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞的分布，并用免疫組化技術(shù)。

該蛋白有沒有其他的修飾形式？

1）網(wǎng)址：www.uniprot.org

了解目的蛋白的基因名、別名、功能、可變剪切體、蛋白表達(dá)位置、可修飾類型等。

2）網(wǎng)址：www.phosphositeplus.org

是蛋白質(zhì)翻譯后修飾權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)，查閱修飾類蛋白的表達(dá)條件和豐度、刺激方式等。

WB實(shí)驗(yàn)流程重點(diǎn)分享

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第一步：樣本制備

樣本制備4個(gè)步驟

樣本制備分為樣本獲取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等4個(gè)關(guān)鍵步驟。

①樣本獲?。航M織或細(xì)胞取材；

②蛋白裂解：從組織或者細(xì)胞中釋放獲取蛋；

③蛋白定量：獲悉蛋白濃度，為后續(xù)電泳步驟提供上樣量依據(jù)；

④蛋白變性：使蛋白變性形成線性結(jié)構(gòu)，方便跑膠和抗體結(jié)合。

樣本制備之裂解液的選擇

▲組織和細(xì)胞破碎過程中常用的裂解液為RIPA裂解液，其中根據(jù)蛋白性質(zhì)的不同，我們選擇的裂解液也不同。

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第二步：凝膠上樣、電泳

操作須知

①凝膠制備：

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。

它有兩種形式：SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）及非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，形成一個(gè)三維網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，它具有分子篩效應(yīng)。

②上樣與電泳：

a）蛋白預(yù)染Marker：采用預(yù)染色標(biāo)記可以看見電泳過程中蛋白遷移的距離，為了便于觀察電泳效果與轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，在電泳時(shí)通常要使用預(yù)染的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)待測(cè)蛋白的分子量大小，挑選合適的Marker。

b）加入足量的樣品：SDS-PAGE根據(jù)蛋白電泳遷移率將其分離，遷移率是蛋白大小和電荷的函數(shù)。我們建議在預(yù)制Tris-Glycine小孔膠上樣20-30μg總蛋白或100ng純蛋白；對(duì)于組織，我們通常建議上樣量最多100μg總蛋白，具體取決于靶標(biāo)表達(dá)水平；但是，如果蛋白水平低于檢測(cè)值，在電泳之前可能還需要進(jìn)行免疫沉淀以富集待測(cè)蛋白。

c）盡量保持每個(gè)泳道的蛋白量一樣，體積盡量一致，方便后續(xù)觀察蛋白的表達(dá)量。

d）空置的泳道用等體積的1x Loading Buffer補(bǔ)齊，防止最后的一兩個(gè)樣品條帶上揚(yáng)。

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第三步：轉(zhuǎn)膜

1.轉(zhuǎn)膜原理

蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，必須及時(shí)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物能牢固結(jié)合蛋白又不影響其抗原活性，這使其比直接在凝膠上檢測(cè)更易操作。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程常采用電轉(zhuǎn)印法包括濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)，與SDS結(jié)合的蛋白帶有負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極遷移，并最終結(jié)合在固相支持物上。

2.膜的選擇

▲現(xiàn)階段常用的轉(zhuǎn)印膜主要是PVDF膜、NC膜這2種，PVDF膜可以提供更好的蛋白截留率、物理強(qiáng)度和廣泛的化學(xué)兼容性。

3.轉(zhuǎn)膜方法

▲轉(zhuǎn)膜的方法分為：濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、干轉(zhuǎn)，其中濕轉(zhuǎn)是轉(zhuǎn)膜最完全、應(yīng)用最廣的方法。

4.轉(zhuǎn)膜必看注意事項(xiàng)

①大分子量蛋白：轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入0.1%的SD5；甲醇濃度降到10%甚至更少，用4℃濕轉(zhuǎn)過夜代替半干法轉(zhuǎn)膜；增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間、電流/電壓；

②小分子量蛋白：去凈緩沖液里的SDS；保持甲醇濃度在20%；用小孔徑的膜；降低轉(zhuǎn)膜時(shí)間、電流/電壓；

③膜的方向確定: 轉(zhuǎn)移后剪角做標(biāo)記，分清正反面；用鉛筆做記號(hào)或電泳時(shí)Marker上成非對(duì)稱的；

④轉(zhuǎn)膜后背景高: 選擇NC膜；

⑤轉(zhuǎn)膜時(shí)污染: 避免手指觸碰膜，可以用鑷子來(lái)取膜，油脂和蛋白質(zhì)會(huì)弄臟膜；

⑥濾紙的大?。捍_保濾紙和膜的大小與膠一致，當(dāng)使用半干法轉(zhuǎn)膜時(shí)，過多的部分會(huì)阻礙電流穿過膜。

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樣第四步：膜封閉本制備

1.封閉的目的

▲轉(zhuǎn)印結(jié)束后，必須將對(duì)印跡膜上未被占據(jù)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉掉以防止非特異性探針結(jié)合。如果沒能將膜上位點(diǎn)全部封閉將會(huì)導(dǎo)致印跡膜出現(xiàn)比較高的背景，因?yàn)楹芏鄼z測(cè)探針也是蛋白，也會(huì)與膜結(jié)合。

2.封閉液的選擇

通常有兩種常用的封閉劑，牛血清白蛋白（BSA）和脫脂奶粉。

一般來(lái)說，脫脂奶粉的封閉效果更強(qiáng)，但有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。

脫脂奶粉：性價(jià)比較高；通常使用濃度為2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因?yàn)槊撝谭壑械睦业鞍妆旧硎且环N磷酸化蛋白，會(huì)結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。

牛血清蛋白（BSA）：通常使用濃度為2%~5%；某些抗體用BSA封閉會(huì)產(chǎn)生比脫脂牛奶更強(qiáng)的信號(hào)，確定抗體使用的特殊需求，選擇適當(dāng)?shù)姆忾]劑。

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第五步：抗體孵育

1.抗體孵育原理

▲一抗識(shí)別膜上蛋白或修飾性抗原表位，二抗識(shí)別一抗恒定區(qū)從而與一抗結(jié)合，最終通過二抗攜帶的熒光或酶顯色信號(hào)，達(dá)到對(duì)樣本中目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)的目的。

2.抗體如何選擇

對(duì)于任何一種目的蛋白，都有不止一種有效抗體；為縮小選擇范圍，我們通?？紤]以下幾個(gè)方面：

①文獻(xiàn)引用：根據(jù)官網(wǎng)了解該抗體發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)量，如果發(fā)現(xiàn)該靶點(diǎn)的抗體有多個(gè)貨號(hào)，那么盡可能選擇發(fā)表文獻(xiàn)較多的貨號(hào)。

②反應(yīng)性：根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬性選擇合適的抗體，比如，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠，那么一抗需要選擇抗小鼠。

③實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)類型選擇廠家驗(yàn)證過的抗體，盡可能選擇的抗體能夠滿足多種類型實(shí)驗(yàn)，保證抗體的使用價(jià)值。

④抗體偶聯(lián)物：標(biāo)簽結(jié)合在抗體上使抗體的結(jié)合可見，選擇標(biāo)簽抗體以檢測(cè)方法的為依據(jù)進(jìn)行選擇。一般推薦使用HRP標(biāo)記二抗，不建議使用堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記二抗，因其不夠靈敏。在二抗種類的選擇上，二抗應(yīng)來(lái)源于產(chǎn)生一抗的物種。

3.抗體孵育、洗滌注意事項(xiàng)

一抗孵育、洗滌：

a.將一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合適比例進(jìn)行稀釋；

b.封閉結(jié)束后，將稀釋好的一抗工作液倒入孵育槽中,室溫2h或4°C過夜。

c.一抗孵育結(jié)束后，加入TBSTBuffer洗滌4次，5min/次；

二抗孵育、洗滌：

a.一抗洗滌結(jié)束前10min，將二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合適比例進(jìn)行稀釋；

b.洗滌結(jié)束后，將稀釋好的二抗工作液加入孵育槽中，室溫1h；

c.二抗孵育結(jié)束后，加入TBSTBuffer洗滌4次，5min/次。

抗體稀釋小tips：

按照抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋使用，有時(shí)一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測(cè)試劑的靈敏度。一般來(lái)說，高倍稀釋一抗可減少非特異性信號(hào)，高倍稀釋酶標(biāo)二抗可最大限度降低整體的高背景。

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第六步：ECL顯影

1.顯影的原理

Western Blot實(shí)驗(yàn)的最后一步，是顯影。拿到高特異性、低背景的顯色圖像，這一步至關(guān)重要。

顯色的原理是實(shí)驗(yàn)中的二抗被HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記，可采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）。ECL靈敏度高、重復(fù)性好，是目前主流的WB顯色方法。

2.具體顯影步驟

▲(1) 在避光環(huán)境中，將 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑 A 液、B 液 1:1 配置，充分混勻；

(2) 將 PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀載物臺(tái)上;

(3) 用移液器吸取適量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，確保工作液均勻覆蓋在整張印跡膜上;

(4) 推入載物臺(tái)，設(shè)置曝光時(shí)間進(jìn)行圖片采集 (可設(shè)置不同的曝光時(shí)間采集圖像，從中選取曝光效果最佳的圖像)。

WB實(shí)驗(yàn)常見問題匯總

1.WB實(shí)驗(yàn)常見問題匯總

由于WB實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)節(jié)多，從樣品制備到顯影，每個(gè)步驟中都可能存在問題。這里為大家匯總了實(shí)驗(yàn)常見問題：

①為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？

a) 你的細(xì)胞中并不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞或查文獻(xiàn)弄清楚；

b)你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗體不能識(shí)別目的蛋白，檢查抗體說明書，看是否有問題。

②我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

a)有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS的濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，一般需96℃以上10-15min左右；

b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)需再加入適量上樣緩沖液。

③我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD左右)，請(qǐng)問怎么做WB？

盡量選擇0.2μm的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間；也可將兩張膜疊在一起再電轉(zhuǎn)。

④我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？

最主要是加大抗原上樣量；同時(shí)也可以將一抗稀釋比例上調(diào)。

⑤膠片背景很臟，有什么解決方法？

減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間和溫度(盡量4℃過夜，此孵育條件比37℃1h要溫和很多)，并提高封閉液濃度。

⑥我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片，是什么原因呢?

a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作，看是否有改善.；

b) 顯影時(shí)間過長(zhǎng)，一般3-5分鐘就夠了，特殊情況需摸索顯色時(shí)間。

2.WB條帶常見問題

①無(wú)特異性條帶原因分析

a）一抗二抗是否使用正確？

種屬：一抗是否適用于樣本種屬；二抗是否匹配一抗；

孵育時(shí)間和用量不足；

如沒問題，4度過夜，抗體濃度提高2-4倍；

b）蛋白上樣量是否足夠？

蛋白上樣量過低，需要增加上樣量；

c）轉(zhuǎn)膜是否充分、完全、過度？

充分：膜與轉(zhuǎn)膜緩沖液浸潤(rùn)以及和膠的充分接觸，可用麗春紅S檢測(cè)，避免甲醇濃度過高抑制蛋白轉(zhuǎn)移；

完全：分子量越大時(shí)間越長(zhǎng)；

過度：小分子量的降低轉(zhuǎn)膜電壓或時(shí)間；

d）洗膜或封閉過度

降低洗膜次數(shù)；

更換或降低封閉劑濃度，減少封閉時(shí)間；

更換抗體稀釋液，由脫脂奶粉換成BSA；

②高背景（有條帶但是背景不正常）

a）一抗或二抗問題

降低抗體濃度和孵育溫度；

避免抗體和封閉劑的非特異性結(jié)合（磷酸化抗體和牛奶）；

b）封閉不完全

BSA換成5%脫脂奶粉；

提高牛奶濃度；

延長(zhǎng)封閉時(shí)間；

c）洗滌不充分（非特異性結(jié)合沒有被完全洗掉）

提高洗滌次數(shù)；

提高吐溫20濃度；

d）曝光時(shí)間過長(zhǎng)（條帶過黑過粗）

減少曝光時(shí)間；

延遲曝光時(shí)間；

e）膜的選擇（當(dāng)背景還是很高）

NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低；

f）蛋白降解

加入蛋白酶抑制劑（可以翻倍加）；

制樣冰上操作；

用新鮮樣本；

g）上樣量過多（條帶粗1秒曝出）

減少上樣量；

③顯色不均勻，負(fù)片

a）蛋白量過多

降低蛋白上樣量；

b）一抗二抗?jié)舛冗^高

加大抗體稀釋度；

3.正常條帶示例

▲正常條帶示例圖，希望大家看完以上內(nèi)容，都能擁有這樣好看的結(jié)果圖。