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Western blotting（免疫印跡分析）是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)樣品中特定蛋白質(zhì)的存在和定量。WB作為一個(gè)最為基礎(chǔ)的生命科學(xué)檢測(cè)方法之一，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間摸索與分析，目前已經(jīng)有了一系列適配性較高的通用WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方案和流程。但是蛋白質(zhì)作為一個(gè)特異性較強(qiáng)的檢測(cè)指標(biāo)，總會(huì)有一些并不適用于常規(guī)化方法的個(gè)體，需要我們對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化或者修改，才能保證得出一個(gè)較為理想的結(jié)果。

小分子蛋白

小分子蛋白主要指WB檢測(cè)中小于20kDa的蛋白質(zhì)，由于分子量小易降解，且?guī)щ姾闪恳蚕鄬?duì)較少，所以導(dǎo)致其吸附能力比較弱。常用的蛋白WB步驟通常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，時(shí)有時(shí)無(wú)，甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)膜失敗，蛋白彌散等完全看不到目標(biāo)條帶的情況。針對(duì)小分子蛋白的WB檢測(cè)，應(yīng)該對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

上樣

通常Western Blot每孔上樣量為30-50 μg，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^(guò)小時(shí)，在跑電泳時(shí)容易出現(xiàn)較為嚴(yán)重的彌散情況，上樣量建議選擇50-100 μg。

電泳

配置SDS-PAGE膠時(shí)，在高濃度的12%-15%的分離膠中進(jìn)行電泳，同時(shí)加大濃縮膠的比例，使得濃縮膠與分離膠的比例約為4：6，甚至可以5：5，這樣可以讓小分子蛋白在濃縮膠中充分的濃縮，在后續(xù)的分離中減少?gòu)浬⒊潭取?/p>

電泳時(shí)，以80v電壓進(jìn)行壓縮，時(shí)間約為40min，電泳至兩種膠的界面。然后將電壓調(diào)整到100v，在12%-15%的分離膠中進(jìn)行電泳，跑到分離膠一半的位置，一般10kDa的marker能夠分開就可以了，目的是避免長(zhǎng)時(shí)間的電泳使得小分子蛋白彌散。

轉(zhuǎn)膜封閉

小分子蛋白由于其分子量小，易降解，吸附能力弱，在轉(zhuǎn)膜時(shí)一般使用0.22μm的PVDF膜，在轉(zhuǎn)膜的時(shí)候，不要在轉(zhuǎn)膜液中加入SDS，防止小分子蛋白與PVDF膜無(wú)法結(jié)合，可以將甲醇的濃度提升至30%，增強(qiáng)蛋白與膜的結(jié)合性。

小分子蛋白實(shí)例詳解

IL-8 Rabbit mAb

IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一種促炎性細(xì)胞因子，大小約為11kDa，通常由許多細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。IL-8在免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，并刺激這些細(xì)胞的激活。

大分子蛋白

大分子蛋白一般指分子量大于200kDa的蛋白質(zhì)，由于其分子量大，遷移速度慢，轉(zhuǎn)膜困難等特征，在WB中有時(shí)可能難以獲得清晰的條帶，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)的遷移和轉(zhuǎn)移可能會(huì)受到影響。

上樣

在樣本制備時(shí)適當(dāng)增加變性時(shí)間和溫度，確保充分變性和還原，以便大分子蛋白完全展開。同時(shí)避免使用過(guò)多的樣品，以免蛋白聚集導(dǎo)致條帶模糊。

電泳

大分子蛋白在電泳時(shí)，使用6%-8%的分離膠，200kDa以上建議6%進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜時(shí)膠比較軟，注意輕拿輕放，避免凝膠破碎，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由于其較慢的遷移速度，建議使用低電壓進(jìn)行電泳。例如，可以選擇在80-100V下運(yùn)行整個(gè)凝膠。這有助于防止蛋白過(guò)快遷移并避免凝膠過(guò)熱，同時(shí)增加電泳時(shí)間，使大蛋白有足夠的時(shí)間遷移。

轉(zhuǎn)膜封閉

大蛋白的轉(zhuǎn)膜通常比較困難，一般使用濕式轉(zhuǎn)移并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間，保證蛋白活性和充分轉(zhuǎn)膜。常用的轉(zhuǎn)膜條件為80v，根據(jù)蛋白的大小，時(shí)間通常設(shè)定為3h-5h，甚至更久的轉(zhuǎn)膜時(shí)間都是可取的。對(duì)于200kDa以上的蛋白，建議20v在4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，可以得到比較好的效果。

大分子蛋白實(shí)例詳解

p300 Rabbit pAb

p300蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，大小為300kDa左右，被稱為組蛋白乙型丙酮乙酸轉(zhuǎn)移酶，是胞漿酶的一種。p300在細(xì)胞核中發(fā)揮重要作用，參與許多細(xì)胞核過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及細(xì)胞增殖和分化等。

跨膜蛋白

膜蛋白在高溫煮沸時(shí)，容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，形成二聚體或多聚體，聚集后分子量變大，造成后續(xù)無(wú)法檢測(cè)到條帶或檢出的條帶位置不對(duì)。故膜蛋白樣品不宜煮沸，建議根據(jù)蛋白具體屬性在50-70 ℃ 左右進(jìn)行熱變性。還有一些對(duì)熱特別敏感的蛋白，對(duì)熱變性的溫度有特殊要求，例如植物樣品。植物中對(duì)熱敏感的蛋白比較多，有的蛋白熱變性溫度需要與感受態(tài)轉(zhuǎn)化溫度（42 ℃）一樣，過(guò)高則檢測(cè)不到。總而言之，如果樣品是膜蛋白，需要根據(jù)樣品本身情況，謹(jǐn)慎調(diào)整熱變性的溫度，以提高檢測(cè)效率。對(duì)于跨膜蛋白，常用可參考的變性溫度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min。

跨膜蛋白實(shí)例詳解

SLC16A3 Rabbit pAb

SLC16A3蛋白是一種單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4（MCT4）蛋白，大小為49kDa左右，它參與乳酸和其他小分子單羧酸物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。這種蛋白在許多生理過(guò)程中發(fā)揮作用，包括能量代謝和pH調(diào)節(jié)。

綜上所述，成功的實(shí)驗(yàn)往往需要前期扎實(shí)的背景調(diào)研和細(xì)致的實(shí)驗(yàn)操作，預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性在于研究人員可以調(diào)整蛋白質(zhì)抽提、電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫印跡等步驟，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并確定最適合的抗體濃度和工作條件，以便成功檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。這有助于確保后續(xù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到正確解釋，從而對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性產(chǎn)生重要影響。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

END

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