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前言:

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，也是科研工作中的重要研究對(duì)象。其中蛋白質(zhì)的含量測定是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)，在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，是一項(xiàng)非常重要的工作。

2020版中國藥典中收錄了6種蛋白質(zhì)含量的測定方法，分別是凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法（Lowry法）、雙縮脲法、2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二羧酸法（BCA法）、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）和紫外-可見分光光度法，另外常用的還有高效液相色譜法（HPLC法）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）。這些方法基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性建立起來的，本文重點(diǎn)是對(duì)這幾種方法的原理和特點(diǎn)進(jìn)行比較。 凱氏定氮法：
原理：蛋白質(zhì)為含氮的有機(jī)化合物，當(dāng)與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時(shí)使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨；然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量算出含氮量，再將含氮量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。除另有規(guī)定外，氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25（蛋白質(zhì)中的含氮量通常占其總質(zhì)量的16%左右，假設(shè)測定物質(zhì)中的氮全來自蛋白質(zhì)，則蛋白質(zhì)含量=含氮量/16%=含氮量×6.25）。
優(yōu)點(diǎn)：（1）該方法為絕對(duì)定量，在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品賦值時(shí)使用，一般不作為常規(guī)的檢定方法；（2）不需要昂貴的儀器設(shè)備。
缺點(diǎn)：操作繁瑣，且靈敏度較低，結(jié)果受非蛋白氮的影響，目前已很少應(yīng)用。 
雙縮脲法：
原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的兩個(gè)以上肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，在540nm處有最大的光吸收，且在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。優(yōu)點(diǎn)：本法快速、靈敏度低，測定范圍通常可達(dá)1～10mg。缺點(diǎn)：此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有H2N—CH＝NH-CH2-NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性，干擾測定的物質(zhì)主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和某些氨基酸等。

Lowry法：
原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物（第一步雙縮脲反應(yīng)），此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。
    優(yōu)點(diǎn)：（1）本法靈敏度較高，適合蛋白質(zhì)的微量測定，測定范圍為40～200μg，定量范圍為5~100μg/ml；（2）該法所用儀器簡單，不同蛋白質(zhì)間的變異少，是蛋白質(zhì)量化的可靠方法，目前國內(nèi)外多數(shù)細(xì)胞因子類制品的蛋白質(zhì)含量采用該法測定。
    缺點(diǎn)：（1）對(duì)本法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多，對(duì)雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應(yīng)，且影響更大（如還原物質(zhì)、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用）；（2）該法反應(yīng)速度慢、耗時(shí)較長。BAC法：
原理：本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物（第一步雙縮脲反應(yīng)），此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

優(yōu)點(diǎn)：（1）本法靈敏度較高，適合蛋白質(zhì)的微量測定，測定范圍為40～200μg，定量范圍為5~100μg/ml；（2）該法所用儀器簡單，不同蛋白質(zhì)間的變異少，是蛋白質(zhì)量化的可靠方法，目前國內(nèi)外多數(shù)細(xì)胞因子類制品的蛋白質(zhì)含量采用該法測定。

缺點(diǎn)：（1）對(duì)本法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多，對(duì)雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應(yīng)，且影響更大（如還原物質(zhì)、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用）；（2）該法反應(yīng)速度慢、耗時(shí)較長。

Bradford法：
原理：本法屬于染料結(jié)合法，考馬斯亮藍(lán)G250是一種甲基取代的三苯基甲烷，每分子包含兩個(gè)磺酸基團(tuán)，呈酸性，該磺酸基團(tuán)能夠通過范德華力與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸結(jié)合形成穩(wěn)定的染料-蛋白藍(lán)色復(fù)合物，在595nm波長處有最大吸收峰，并且在一定濃度范圍內(nèi)，復(fù)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

優(yōu)點(diǎn)：（1）本法靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，通常可測定1～200μg的蛋白質(zhì)量；（2）本法測定簡便、快速、需要供試品量少，只需加一種試劑，反應(yīng)10min。

缺點(diǎn)：（1）本法較Lowry法的干擾物質(zhì)少，但是仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，如去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等，供試品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色；（2）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差。
紫外-可見分光光度法：
原理：蛋白質(zhì)分子中的芳香族氨基酸，包括色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸，含有可以吸收紫外光的共軛雙鍵，在280nm波長處有最大吸收峰，且在此波長內(nèi)吸光度與其濃度成線性關(guān)系。通過分光光度計(jì)檢測目標(biāo)蛋白280nm處的波長，即可根據(jù)Beer-Lambert定律（A=E*C*l；A代表吸光度，E代表消光系數(shù)，C代表蛋白質(zhì)濃度，l代表光徑長度，其中消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列估測）換算出目標(biāo)蛋白的濃度。

優(yōu)點(diǎn)：（1）本法操作簡便快速，具有無與倫比的便捷性和高效性，可以通過Nanodrop等儀器在幾秒內(nèi)直接讀出一個(gè)樣本的蛋白濃度；（2）本法的靈敏度較高，可以達(dá)到微克級(jí)別，適用于較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)檢測，一般供試品濃度為0.2～2mg/ml；（3）本法不用額外添加檢測試劑，對(duì)蛋白質(zhì)無破壞性，不影響蛋白活性。

缺點(diǎn)：但本法準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，因?yàn)楹芏嗷衔镌?80nm處有吸光值，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，尤其是核酸存在嚴(yán)重干擾，故要準(zhǔn)確測量，必須要有待測蛋白質(zhì)或其它蛋白的純品作標(biāo)準(zhǔn)品參考。
HPLC法：
原理：溶于流動(dòng)相中的樣品各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。
特點(diǎn)：具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，多用于成品的質(zhì)量控制，且需要同種蛋白質(zhì)做為標(biāo)準(zhǔn)品。
ELISA法：
原理：特異蛋白含量測定方法，將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于微孔板內(nèi)，加入待檢樣品，通過酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢樣品的存在與否或者量的多少。
特點(diǎn)：該法特異性強(qiáng)、靈敏度高、可同時(shí)測定多個(gè)樣品，適用于生產(chǎn)過程中目標(biāo)蛋白質(zhì)含量的測定。

通過以上對(duì)比我們不難發(fā)現(xiàn)，對(duì)于蛋白質(zhì)含量測定，每一種方法都有自身的優(yōu)勢和缺陷，目前依舊沒有一個(gè)完美的解決方案，針對(duì)同一樣本采用不同的方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)偏差。因此不同品種應(yīng)針對(duì)自身蛋白質(zhì)特性選擇適宜的測定方法并做相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)盡可能選用與待測定品種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相同或相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)品，這樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才會(huì)更可靠。

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