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結(jié)果β-半乳糖苷酶染色（β-Galactosidase Staining）是一種常用的細(xì)胞或組織活性檢測方法。這種染色方法基于衰老時SA-β-Gal（senescence-associated β-galactosidase）活性水平上調(diào)，可以對衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測。在普通的光學(xué)顯微鏡下就可以觀測到細(xì)胞或組織的衰老情況。

不同類型樣本實驗操作

1. 細(xì)胞樣本染色

1

 貼壁細(xì)胞

① 對于 6 孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室溫固定 15 分鐘。

② 吸除固定液，用 PBS 或 HBSS 洗滌細(xì)胞 3 次，每次 3 分鐘。

③ 吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 毫升 SA-β-gal 染色液。

④ 37 ℃ 孵育過夜，可以用保鮮膜封住防止染色液蒸發(fā)。

⑤普通光學(xué)顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數(shù)，可以去除染色工作液，加入 2 ml PBS，4 ℃ 可以保存數(shù)天；或者加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存較長時間。

2

懸浮細(xì)胞

① 離心收集細(xì)胞至 1.5 ml 離心管內(nèi)，用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室溫固定 15 分鐘。固定時可以在搖床上緩慢搖動，以避免細(xì)胞結(jié)成團(tuán)塊。

② 離心，吸除細(xì)胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗滌細(xì)胞 3 次，每次 3 分鐘。

③ 離心，吸除 PBS 或 HBSS，每管加入 0.5~1 毫升 SA-β-gal 染色液。

④ 37 ℃ 孵育過夜。

⑤ 取部分染色后的細(xì)胞，滴加到載玻片上或孔板內(nèi)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數(shù)，可以離心，去除染色工作液，然后加入 1 ml PBS，4 ℃ 可以保存數(shù)天。如果離心，取細(xì)胞用于涂片，加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存較長時間。

2. 石蠟切片樣本操作

① 將石蠟組織切片置于65°C恒溫箱，烤片1h左右。脫蠟。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min。

② 1xPBS洗滌3次，每次3-5min。

3.  冰凍切片樣本操作

① 加入適當(dāng)體積的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15min。1xPBS洗滌3次，每次5min，吸除PBS或HBSS。

② 加入適當(dāng)染色工作液，37℃孵育過夜，最好把整個切片浸泡在染色工作液中。

注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

③ 1xPBS洗滌3次，每次5min

④ 脫水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min

⑤ 中性樹膠封片。

⑥ 普通光學(xué)顯微鏡下觀察。光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)-半乳糖苷酶的細(xì)胞如不能及時觀察計數(shù)，可以去除染色工作液，加入2mlPBS，4℃保存。

常見問題及注意事項

1. 細(xì)胞樣本染色

1. β-Gal?Fixative有一定的腐蝕性和氣味，操作時請注意防護(hù)。

2

 片子有大量雜質(zhì)

① 工作液需要完全融化，必要時可在 37 ℃ 烘箱中溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，低溫會使工作液再次結(jié)晶。

② 試劑盒可能過期變質(zhì)；可用 70% 乙醇輕柔沖洗幾次。

3

染色過深或過淺

染色時間、分化時間過長或不夠，染色過程可在鏡下控制，適當(dāng)調(diào)整時間。

4

切片染色不均

① 取材固定不當(dāng)，取材規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，固定徹底；脫水不夠，重新脫水、透明、浸蠟。

② X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。細(xì)胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈，均會影響后續(xù)的酶反應(yīng)。

5

樣品固定要求

樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24小時以上，固定時樣品切勿冷凍結(jié)冰。

運輸要求：固定好的樣品常溫運輸送樣；冰凍切片-20℃運輸。

6

染色液的配制

染色液應(yīng)該在無菌環(huán)境下配制，以避免污染。使用聚丙烯容器配制染色工作液，不能使用聚苯乙烯容器配制，例如普通的6孔板就可以用作染色的容器。加入染色液后，可能有結(jié)晶形成影響觀察，可去除染色液后，用 70% 乙醇洗滌，待結(jié)晶溶解后換成 PBS，再觀察。

7.β-半乳糖苷酶染色反應(yīng)依賴于特定的pH條件，不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行染色反應(yīng)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的二氧化碳培養(yǎng)箱中較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH值，而導(dǎo)致染色失敗。

結(jié)果β-半乳糖苷酶染色（β-Galactosidase Staining）是一種常用的細(xì)胞或組織活性檢測方法。這種染色方法基于衰老時SA-β-Gal（senescence-associated β-galactosidase）活性水平上調(diào)，可以對衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測。在普通的光學(xué)顯微鏡下就可以觀測到細(xì)胞或組織的衰老情況。

END

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