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蛋白實驗干貨-蛋白提取-蛋白定量-實驗步驟-問題處理

瀏覽:1249 發(fā)表時間:2024-10-15

一、  產品用途   

一、WB實驗介紹

      

“ Western Blot



      WB(Western Blot,蛋白免疫印跡)是一種常規(guī)的蛋白分析技術,常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。


WB實驗的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應,通過變性膠 SDS-PAGE 將不同分子量的蛋白質分離開,然后轉移到固相載體 PVDF 膜上,再用脫脂牛奶作為封閉液進行封閉和一抗稀釋液進行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結合后,用 TBST 洗脫液洗脫掉多余未結合的一抗,加入帶有 HRP 標記的對應二抗,這樣,我們的蛋白+一抗+二抗形成一個復合物,加以化學發(fā)光液,有靶蛋白的位置就會產生熒光,利用膠片或者化學發(fā)光儀就可以顯現靶蛋白的條帶顯現。


WB常規(guī)實驗流程:蛋白提取→蛋白定量→制膠→電泳→轉膜→封閉→一抗孵育→一抗洗脫→二抗孵育→二抗洗脫→化學發(fā)光→數據分析。

WB實驗流程圖

(圖片來自網絡,侵聯(lián)刪)






二、WB實驗試劑配置




在實驗開始之前,可以按以下配方比例配置實驗所需試劑。


一. 電泳 緩沖液

取 電泳緩沖液干粉,溶解于 1L 純水中,置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

二. 轉膜 緩沖液

取 轉膜緩沖液干粉,溶解于 800mL 純水中,加入 200mL 的甲醇,置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

三. TBST 緩沖液

取 TBS 粉劑,溶解于 2L 純水中,加入 1mL 吐溫20,置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。


四. 5%脫脂牛奶稱量 5g 脫脂奶粉,溶解于 100mL TBST 溶液中,置于磁力攪拌器上攪拌至少 30分鐘,然后放入 4℃冰箱暫放。
五. 完全裂解液1mL RIPA 裂解液+20μL cocktail+10μL磷酸化蛋白酶抑制劑 A+10μL 磷酸化蛋白酶抑制劑 B+10μL PMSF,除 RIPA 外,其他四種試劑使用前幾分鐘加入,現配現用。


三、WB實驗步驟



由于文章篇幅限制,小編這次先介紹組織或細胞的蛋白提取和蛋白定量常規(guī)流程。蛋白提取

1 組織總蛋白提取

準備好所需要數量的樣本管;放入研磨珠,置于冰盒上備用;


組織塊先用預冷 PBS洗滌 2-3 次,除去血污,然后放在濾紙上,吸盡多余的 PBS 后放入對應的勻漿管中,加入大約 10 倍樣本體積的完全裂解液,置于組織研磨儀中,對稱放置,確認放置平衡后,蓋好蓋子,選擇程序開始勻漿。


Tips

① 芝麻大小的組織,一般加入100-200μL 完全裂解液;綠豆大小組織加入 400-600μL 完全裂解液;黃豆大小組織加入 800-1000μL完全裂解液。

② 研磨儀參考參數:2mm 氧化鋯珠 8-12顆,頻率6.5m/s,時間30s。如果一次勻漿不徹底,可以再次勻漿)。如果組織塊比較大,可提前用剪刀將組織塊剪碎。



2 懸浮細胞提取蛋白

將細胞連帶培養(yǎng)基一起吸入 15mL 離心管中,4℃,2000rpm,離心 5分鐘,去掉上清;


加入 1mL PBS 溶液重懸細胞,將細胞轉移到 1.5mL 離心管中,然后 4℃,2000rpm,離心 5分鐘,去掉上清,保留沉淀,重復此步驟 2-3 次(此步驟目的為清洗細胞中殘留的培養(yǎng)基);


根據細胞沉淀的量加入適量的完全裂解液,例如沉淀體積為綠豆大?。ù蟾?10uL 左右)的加入大約 200μL 完全裂解液,加入適量研磨珠,放入研磨儀進行裂解;


裂解完成后,12000rpm,4℃,離心 10分鐘,上清即為總蛋白溶液。


3 貼壁細胞提取蛋白

倒掉培養(yǎng)基,沿細胞培養(yǎng)皿側壁或者培養(yǎng)瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液,輕輕晃動平皿或者培養(yǎng)瓶,然后將細胞培養(yǎng)皿/瓶傾斜放置,用移液槍輕輕吸除殘余液體,盡量輕柔,不要將細胞沖掉,清洗 2-3 次,最后一次將殘余 PBS 完全吸干;


加入適當體積的完全裂解液(例如六孔板各單孔細胞長滿的話,加入大約 250μL完全裂解液),反復晃動細胞培養(yǎng)皿/瓶,讓裂解液與細胞完全接觸,用細胞刮刀將細胞刮下來,收集后,加入研磨珠,放入研磨儀中進行裂解;


裂解完成后,12000rpm,4℃,離心 10分鐘,上清即為總蛋白溶液。


蛋白定量

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液,用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒測蛋白濃度,蛋白濃度測定方法如下:

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01

配制蛋白標準貯備液

取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品(BSA)蛋白標準管中,將25 mg蛋白標準品完全溶解,即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。

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02

配制蛋白標準工作液

取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液,用PBS或生理鹽水稀釋50倍,得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋,確保稀釋準確。

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03

繪制標準曲線(酶標儀法)

將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中,然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

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04

準備待測樣品

將待測的蛋白樣品進行適當稀釋(可通過預實驗檢測,使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內,確保檢測結果可信),按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。

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05

配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存,24 h內使用。每個待測樣品需200 μL,建議按需配制,避免浪費。

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06

檢測

向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL,充分混勻(可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s),37℃反應30 min后,以標準曲線0號做參比,在562 nm波長下比色測定,記錄各孔吸光度值。(注:也可以在室溫反應2 h,或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低,建議置于60℃反應)

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07

計算

以標準曲線中梯度蛋白含量(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值,在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度(μg/mL),再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。


Tips

1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大,吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化,如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度,建議每次測定都需要做標準曲線。


2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時,需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋,不要一次稀釋50倍,以免產生較大誤差。


3. 為保證蛋白的精確定量,樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液,同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值,建議使用其他的方法測定。


4. 操作時請穿實驗服,并佩戴一次性手套。

WB實驗步驟

電泳分離膠濃度6%/8%/10%/12%/15%,搭配上層膠溶液B中的紅色或綠色染料,多種搭配任你選擇,蛋白點樣孔清晰可見,提高點樣效率。

1

清洗玻璃板

用洗滌劑清洗垂直電泳儀玻璃板,清水沖洗兩次,再用純水漂洗一次,自然晾干或者使用風扇吹干;

2

 配置分離膠和濃縮膠

根據目的蛋白分子量和所選電泳緩沖液不同,選擇合適濃度的SDS-PAGE下層膠,參照表格如下:

配制10% AP溶液:稱取AP(過硫酸銨)粉末0.1 g,用1 mL純水完全溶解。該溶液4℃存貯1-2周有效,-20℃保存3個月有效;

根據實驗需求,等比例混合對應的溶液A和B,加入適量的10% AP溶液,分別配制下層膠溶液、上層膠溶液。不同規(guī)格以及不同厚度的玻璃板可以等比例調整上層膠和下層膠溶液的配制體積,以常用規(guī)格約8.3 cm×7.3 cm 凝膠板和10% SDS-PAGE彩色(紅色)凝膠超快速配制試劑盒為例,推薦配制體系如下表格:


Tips

配膠試劑里面的 AP 需要根據實驗室實際溫度來適量的增加或者減少,比如夏天溫度較高,自然凝膠速度較快,AP 的量需要適當的減少;冬天溫度低,凝膠慢,需要適量的增加。



3

 制膠 

向兩塊玻璃板中間膠室中緩慢注入配制好的下層膠溶液至膠室的三分之二到四分之三處(根據實際實驗需求來定),然后使用雙蒸餾水左右移動均勻加至膠室內,使其起到密封作用(加樣時請務必小心,避免產生氣泡)。靜置15-30 min左右等待凝膠聚合,倒出雙蒸餾水,并用吸水紙清理膠室殘留液體。


使用配制的上層膠溶液加樣灌滿膠室(高度至凹板玻璃缺口上沿),隨后插入加樣梳子。等待約15-30 min凝膠完全聚合后,制膠過程完成。

4

 上樣電泳 

等濃縮膠凝固好,拔掉梳子,如果點樣孔彎曲,可用上樣針撥正,之后可上樣,Marker孔加入5-10μL蛋白Marker,其余蛋白總上樣量30-50μg。將制膠器放進電泳槽,倒入電泳緩沖液,連接電泳電源,將電壓調至 60-90V ;樣品進入分離膠之后,將電壓調至 120-150V,等到溴酚藍指示劑距離膠最底部大約 1cm,即可終止電泳 (想要更快完成電泳實驗,或對小分子蛋白分離要求更高。

Tips

1、注意保證上樣體積盡量一致,否則可能導致蛋白條帶不在同一水平線;如有空置的加樣孔,需加等體積的1×loading buffer,以防相鄰通道蛋白樣品的擴散;上樣時需緩慢加,切忌快速吹打以免引起蛋白樣品溢出,此外,上樣體積要小于上樣孔的總體積。

2、電泳液一般要求內槽加滿,外槽加到 1/4 即可。1.0mm 玻璃板最多點樣 20μL,1.5mm最多可以點 40uL; 濃縮膠電壓需要根據溫度來選擇,室溫較高,電壓低一些,室溫較低,濃縮膠電壓高一些(夏天一般建議濃縮膠電壓 75V,冬天 90V,分離膠固定為 150V 高電壓。具體調電壓時間可以參考 marker,如果發(fā)現 marker 分開了,說明蛋白進入了分離膠。夏天溫度比較高的時候需要將電泳槽放在冰水里面降溫,防止溫度過高使凝膠變形。



電泳相關常見問題和處理方法

電泳步驟操作不當可能會導致條帶結果有問題,小賽總結了一些電泳相關常見問題和對應的處理方法,希望能給大家啟發(fā)~

“微笑”現象

條帶出現微笑現象(中間凹兩邊翹起):主要由于凝膠中間部分凝固不均。

處理方法:應待凝膠充分凝固后電泳,或者加入催化劑后充分混勻。


拖尾現象

條帶出現拖尾現象:主要是樣本溶解效果不佳,或分離膠濃度過大,或電泳緩沖液放置時間過長。

處理方法:加樣前離心;加適量的樣品促溶劑;降低凝膠濃度或使用梯度凝膠;重新配置電泳緩沖液。


條帶過粗

條帶過粗:可能是上樣量過大;濃縮膠未濃縮好;濃縮膠pH值不正確;電壓過高。

處理方法:減少上樣量;增加濃縮膠長度;保證濃縮膠的pH正確(6.8);降低電壓。


紋理現象

條帶出現紋理現象:可能是樣本中不溶性顆粒引起的。

處理方法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。


條帶不整齊

條帶不整齊:

可能是由于膠凝固不均勻,建議待膠完全凝固后上樣;

可能是由于電泳的時候,有氣泡在膠的下邊緣,建議電泳前,檢查并趕走膠底部的氣泡;

可能是由于上樣buffer不是工作液濃度,建議重新配置上樣buffer;

可能是由于拔梳子導致樣品孔不齊,建議水平緩慢的拔梳子。


END


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