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一、  產(chǎn)品用途   

一、WB實(shí)驗(yàn)介紹

“ Western Blot

      WB（Western Blot，蛋白免疫印跡）是一種常規(guī)的蛋白分析技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

WB實(shí)驗(yàn)的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應(yīng)，通過(guò)變性膠 SDS-PAGE 將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開(kāi)，然后轉(zhuǎn)移到固相載體 PVDF 膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進(jìn)行封閉和一抗稀釋液進(jìn)行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結(jié)合后，用 TBST 洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有 HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個(gè)復(fù)合物，加以化學(xué)發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會(huì)產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學(xué)發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

WB常規(guī)實(shí)驗(yàn)流程：蛋白提取→蛋白定量→制膠→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→一抗洗脫→二抗孵育→二抗洗脫→化學(xué)發(fā)光→數(shù)據(jù)分析。

WB實(shí)驗(yàn)流程圖

（圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，侵聯(lián)刪）

二、WB實(shí)驗(yàn)試劑配置

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，可以按以下配方比例配置實(shí)驗(yàn)所需試劑。

一. 電泳 緩沖液

取 電泳緩沖液干粉，溶解于 1L 純水中，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

二. 轉(zhuǎn)膜 緩沖液

取 轉(zhuǎn)膜緩沖液干粉，溶解于 800mL 純水中，加入 200mL 的甲醇，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

三. TBST 緩沖液

取 TBS 粉劑，溶解于 2L 純水中，加入 1mL 吐溫20，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

四. 5%脫脂牛奶稱量 5g 脫脂奶粉，溶解于 100mL TBST 溶液中，置于磁力攪拌器上攪拌至少 30分鐘，然后放入 4℃冰箱暫放。
五. 完全裂解液1mL RIPA 裂解液+20μL cocktail+10μL磷酸化蛋白酶抑制劑 A+10μL 磷酸化蛋白酶抑制劑 B+10μL PMSF，除 RIPA 外，其他四種試劑使用前幾分鐘加入，現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、WB實(shí)驗(yàn)步驟

由于文章篇幅限制，小編這次先介紹組織或細(xì)胞的蛋白提取和蛋白定量常規(guī)流程。蛋白提取

1 組織總蛋白提取

準(zhǔn)備好所需要數(shù)量的樣本管；放入研磨珠，置于冰盒上備用；

組織塊先用預(yù)冷 PBS洗滌 2-3 次，除去血污，然后放在濾紙上，吸盡多余的 PBS 后放入對(duì)應(yīng)的勻漿管中，加入大約 10 倍樣本體積的完全裂解液，置于組織研磨儀中，對(duì)稱放置，確認(rèn)放置平衡后，蓋好蓋子，選擇程序開(kāi)始勻漿。

Tips

①　芝麻大小的組織，一般加入100-200μL 完全裂解液；綠豆大小組織加入 400-600μL 完全裂解液；黃豆大小組織加入 800-1000μL完全裂解液。

②　研磨儀參考參數(shù)：2mm 氧化鋯珠 8-12顆，頻率6.5m/s，時(shí)間30s。如果一次勻漿不徹底，可以再次勻漿）。如果組織塊比較大，可提前用剪刀將組織塊剪碎。

2 懸浮細(xì)胞提取蛋白

將細(xì)胞連帶培養(yǎng)基一起吸入 15mL 離心管中，4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清；

加入 1mL PBS 溶液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中，然后 4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清，保留沉淀，重復(fù)此步驟 2-3 次（此步驟目的為清洗細(xì)胞中殘留的培養(yǎng)基）；

根據(jù)細(xì)胞沉淀的量加入適量的完全裂解液，例如沉淀體積為綠豆大小（大概 10uL 左右）的加入大約 200μL 完全裂解液，加入適量研磨珠，放入研磨儀進(jìn)行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

3 貼壁細(xì)胞提取蛋白

倒掉培養(yǎng)基，沿細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁或者培養(yǎng)瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，輕輕晃動(dòng)平皿或者培養(yǎng)瓶，然后將細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶?jī)A斜放置，用移液槍輕輕吸除殘余液體，盡量輕柔，不要將細(xì)胞沖掉，清洗 2-3 次，最后一次將殘余 PBS 完全吸干；

加入適當(dāng)體積的完全裂解液（例如六孔板各單孔細(xì)胞長(zhǎng)滿的話，加入大約 250μL完全裂解液），反復(fù)晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶，讓裂解液與細(xì)胞完全接觸，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)，收集后，加入研磨珠，放入研磨儀中進(jìn)行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

蛋白定量

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白濃度，蛋白濃度測(cè)定方法如下：

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01

配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液

取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長(zhǎng)期保存。

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02

配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

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03

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）

將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

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04

準(zhǔn)備待測(cè)樣品

將待測(cè)的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測(cè)結(jié)果可信），按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測(cè)樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

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05

配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個(gè)待測(cè)樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費(fèi)。

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06

檢測(cè)

向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測(cè)樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比，在562 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）

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07

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測(cè)樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品實(shí)際蛋白濃度。

Tips

1. BCA法測(cè)定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大，吸光度值會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，建議每次測(cè)定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時(shí)，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測(cè)條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測(cè)定。

4. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套。

WB實(shí)驗(yàn)步驟

電泳分離膠濃度6%/8%/10%/12%/15%，搭配上層膠溶液B中的紅色或綠色染料，多種搭配任你選擇，蛋白點(diǎn)樣孔清晰可見(jiàn)，提高點(diǎn)樣效率。

1

清洗玻璃板

用洗滌劑清洗垂直電泳儀玻璃板，清水沖洗兩次，再用純水漂洗一次，自然晾干或者使用風(fēng)扇吹干；

2

 配置分離膠和濃縮膠

根據(jù)目的蛋白分子量和所選電泳緩沖液不同，選擇合適濃度的SDS-PAGE下層膠，參照表格如下：

配制10% AP溶液：稱取AP（過(guò)硫酸銨）粉末0.1 g，用1 mL純水完全溶解。該溶液4℃存貯1-2周有效，-20℃保存3個(gè)月有效；

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，等比例混合對(duì)應(yīng)的溶液A和B，加入適量的10% AP溶液，分別配制下層膠溶液、上層膠溶液。不同規(guī)格以及不同厚度的玻璃板可以等比例調(diào)整上層膠和下層膠溶液的配制體積，以常用規(guī)格約8.3 cm×7.3 cm 凝膠板和10% SDS-PAGE彩色(紅色)凝膠超快速配制試劑盒為例，推薦配制體系如下表格：

Tips

配膠試劑里面的 AP 需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際溫度來(lái)適量的增加或者減少，比如夏天溫度較高，自然凝膠速度較快，AP 的量需要適當(dāng)?shù)臏p少；冬天溫度低，凝膠慢，需要適量的增加。

3

 制膠 

向兩塊玻璃板中間膠室中緩慢注入配制好的下層膠溶液至膠室的三分之二到四分之三處（根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求來(lái)定），然后使用雙蒸餾水左右移動(dòng)均勻加至膠室內(nèi)，使其起到密封作用（加樣時(shí)請(qǐng)務(wù)必小心，避免產(chǎn)生氣泡）。靜置15-30 min左右等待凝膠聚合，倒出雙蒸餾水，并用吸水紙清理膠室殘留液體。

使用配制的上層膠溶液加樣灌滿膠室（高度至凹板玻璃缺口上沿），隨后插入加樣梳子。等待約15-30 min凝膠完全聚合后，制膠過(guò)程完成。

4

 上樣電泳 

等濃縮膠凝固好，拔掉梳子，如果點(diǎn)樣孔彎曲，可用上樣針撥正，之后可上樣，Marker孔加入5-10μL蛋白Marker，其余蛋白總上樣量30-50μg。將制膠器放進(jìn)電泳槽，倒入電泳緩沖液，連接電泳電源，將電壓調(diào)至 60-90V ；樣品進(jìn)入分離膠之后，將電壓調(diào)至 120-150V，等到溴酚藍(lán)指示劑距離膠最底部大約 1cm，即可終止電泳 （想要更快完成電泳實(shí)驗(yàn)，或?qū)π》肿拥鞍追蛛x要求更高。

Tips

1、注意保證上樣體積盡量一致，否則可能導(dǎo)致蛋白條帶不在同一水平線；如有空置的加樣孔，需加等體積的1×loading buffer，以防相鄰?fù)ǖ赖鞍讟悠返臄U(kuò)散；上樣時(shí)需緩慢加，切忌快速吹打以免引起蛋白樣品溢出，此外，上樣體積要小于上樣孔的總體積。

2、電泳液一般要求內(nèi)槽加滿，外槽加到 1/4 即可。1.0mm 玻璃板最多點(diǎn)樣 20μL，1.5mm最多可以點(diǎn) 40uL; 濃縮膠電壓需要根據(jù)溫度來(lái)選擇，室溫較高，電壓低一些，室溫較低，濃縮膠電壓高一些（夏天一般建議濃縮膠電壓 75V，冬天 90V,分離膠固定為 150V 高電壓。具體調(diào)電壓時(shí)間可以參考 marker，如果發(fā)現(xiàn) marker 分開(kāi)了，說(shuō)明蛋白進(jìn)入了分離膠。夏天溫度比較高的時(shí)候需要將電泳槽放在冰水里面降溫，防止溫度過(guò)高使凝膠變形。

電泳相關(guān)常見(jiàn)問(wèn)題和處理方法

電泳步驟操作不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致條帶結(jié)果有問(wèn)題，小賽總結(jié)了一些電泳相關(guān)常見(jiàn)問(wèn)題和對(duì)應(yīng)的處理方法，希望能給大家啟發(fā)~

“微笑”現(xiàn)象

條帶出現(xiàn)微笑現(xiàn)象(中間凹兩邊翹起)：主要由于凝膠中間部分凝固不均。

處理方法：應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者加入催化劑后充分混勻。

拖尾現(xiàn)象

條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：主要是樣本溶解效果不佳，或分離膠濃度過(guò)大，或電泳緩沖液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

處理方法：加樣前離心；加適量的樣品促溶劑；降低凝膠濃度或使用梯度凝膠；重新配置電泳緩沖液。

條帶過(guò)粗

條帶過(guò)粗：可能是上樣量過(guò)大；濃縮膠未濃縮好；濃縮膠pH值不正確；電壓過(guò)高。

處理方法：減少上樣量；增加濃縮膠長(zhǎng)度；保證濃縮膠的pH正確（6.8）；降低電壓。

紋理現(xiàn)象

條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象：可能是樣本中不溶性顆粒引起的。

處理方法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

條帶不整齊

條帶不整齊：

可能是由于膠凝固不均勻，建議待膠完全凝固后上樣；

可能是由于電泳的時(shí)候，有氣泡在膠的下邊緣，建議電泳前，檢查并趕走膠底部的氣泡；

可能是由于上樣buffer不是工作液濃度，建議重新配置上樣buffer；

可能是由于拔梳子導(dǎo)致樣品孔不齊，建議水平緩慢的拔梳子。

END

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