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干貨：細(xì)胞培養(yǎng)保姆級(jí)實(shí)戰(zhàn)攻略

細(xì)胞是生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，藥物、基因功能、疾病機(jī)理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細(xì)胞水平進(jìn)行闡釋。而細(xì)胞培養(yǎng)，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細(xì)胞培養(yǎng)中常常會(huì)遇到很多的細(xì)節(jié)問題，而每個(gè)問題都有可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。我們匯總了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室多年來的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)分享給大家，希望能給大家的細(xì)胞培養(yǎng)提供參考。

01

細(xì)胞系身份需明確

  我們之所以選定某種細(xì)胞系開展實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)樗x細(xì)胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達(dá)特性等。一旦用錯(cuò)了細(xì)胞株，對(duì)我們研究結(jié)果的判斷就會(huì)帶來很大的誤差和不確定性。

而近年來，多個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系在培養(yǎng)和流通過程中，出現(xiàn)了很嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，單就HeLa細(xì)胞系導(dǎo)致的污染致使3萬(wàn)多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性存在問題，而這種情況不僅僅限于HeLa細(xì)胞。多個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)研究人員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)超過451個(gè)細(xì)胞系已被其它細(xì)胞完全吸收，在所檢測(cè)細(xì)胞中污染占比46%，可見細(xì)胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此，做實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞株驗(yàn)明正身非常重要。如果是在機(jī)構(gòu)購(gòu)買的細(xì)胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報(bào)告。

目前，STR基因分型方法是進(jìn)行細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的最有效和準(zhǔn)確的方法之一，是ATCC等權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定的金標(biāo)準(zhǔn)。不過可惜的是并非所有細(xì)胞均可進(jìn)行STR鑒定，目前只有大部分的人源細(xì)胞株和45個(gè)種類的小鼠細(xì)胞株可以進(jìn)行鑒定。其他細(xì)胞株可以結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、特性和物種鑒定來進(jìn)行確認(rèn)。

02

培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇

1.準(zhǔn)備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性，提前準(zhǔn)備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細(xì)胞原來的培養(yǎng)條件，以免細(xì)胞在新環(huán)境下還需要過渡適應(yīng)。同時(shí)，充分了解到細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和形態(tài)特征，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細(xì)胞傳代：

1）移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶?jī)?nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會(huì)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞層能自然流下，此時(shí)應(yīng)加入2-3ml含血清的完全培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞解離所需時(shí)間請(qǐng)參考各細(xì)胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶?jī)A斜，吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長(zhǎng)表面，重復(fù)該動(dòng)作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對(duì)于難消化的細(xì)胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生物理?yè)p傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細(xì)胞分出來，及時(shí)終止消化。然后再對(duì)仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化，避免易消化細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清完全培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)足新的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

3.懸浮細(xì)胞傳代：

因懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。

1）直接傳代時(shí)，靜置5-10分鐘，待懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液，補(bǔ)足新鮮的含血清完全培養(yǎng)液，混勻成細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時(shí)，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清完全培養(yǎng)液重懸。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)足新鮮的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細(xì)胞傳代：

先將懸浮的細(xì)胞收集，再參考“貼壁細(xì)胞傳代”方法進(jìn)行消化收集，一起接種到培養(yǎng)器皿中。

PS: 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)中一般對(duì)細(xì)胞密度要求比較高，培養(yǎng)中最好參考指南控制好細(xì)胞密度，不能過密也不能過稀。

5.細(xì)胞凍存：

1）按照“細(xì)胞傳代步驟”中的方法收集細(xì)胞。

2）加入細(xì)胞凍存液（一般10%DMSO+對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液），使細(xì)胞的終密度為(5~10)×105個(gè)/ml，移入細(xì)胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無法滲透到細(xì)胞，易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細(xì)胞受損。）

6.細(xì)胞復(fù)蘇：

1）取出貯存的細(xì)胞，待液氮揮發(fā)后，馬上37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化（通常2min內(nèi)，時(shí)間長(zhǎng)了細(xì)胞狀態(tài)會(huì)受影響）。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂，操作該步時(shí)請(qǐng)配戴防護(hù)面罩或防護(hù)目鏡。

PS：干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。

2）轉(zhuǎn)移到無菌操作臺(tái)，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清完全培養(yǎng)液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以約(3~5)×105個(gè)/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

03

污染防治

1.細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不完全的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長(zhǎng)桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

左邊的就是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會(huì)延軸向快速游動(dòng)，量少時(shí)培養(yǎng)基澄清。右圖是顆粒狀污染，一般培養(yǎng)基會(huì)渾濁或有白色沙狀沉淀。 

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁；厭氧菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)觀察到渾濁現(xiàn)象。

污染處理：由于國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細(xì)菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周，效果相對(duì)還不錯(cuò)。

2. 真菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素B/T25瓶，處理一周。

注：兩性霉素毒性較大，需要在細(xì)胞有50%以上且狀態(tài)沒受大影響前處理。 

3.支原體污染

支原體的危害：支原體污染可以改變細(xì)胞的特性。例如部分支原體會(huì)快速消耗培養(yǎng)液中的精氨酸，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，從而使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢或停止；同時(shí)支原體還可以改變細(xì)胞的酶譜、細(xì)胞膜成分，造成細(xì)胞染色體異?；蚣?xì)胞病理性改變等。上述情況會(huì)嚴(yán)重影響到使用這些細(xì)胞所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論不可靠。

（PCR法檢測(cè)細(xì)胞上清中的支原體污染）l

支原體的預(yù)防與清除：由于支原體無法在鏡下直接看到，需要通過PCR法等進(jìn)行檢測(cè)才發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)污染后比較難發(fā)現(xiàn)。建議在養(yǎng)細(xì)胞每月檢測(cè)一次并結(jié)合每周抽檢，做到有污染早發(fā)現(xiàn)。對(duì)于正在進(jìn)行支原體去除處理的細(xì)胞建議每周必檢，直至出現(xiàn)陰性結(jié)果并至少維持一月。不同的細(xì)胞分開處理，優(yōu)先處理“支原體陰性”細(xì)胞，后處理正在做去除處理的和受感染的細(xì)胞。同時(shí)，新引進(jìn)的細(xì)胞系都進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保不給實(shí)驗(yàn)室?guī)硇碌奈廴尽?/p>

4.實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞污染防治

建立良好的規(guī)章制度對(duì)減少細(xì)胞污染會(huì)有很大的幫助。包括準(zhǔn)入制度、操作規(guī)范和日常管理制度。

準(zhǔn)入制度：包括了人員的和物料的。人員需要進(jìn)行培訓(xùn)之后才能自己進(jìn)行操作，而且要符合穿戴要求才能進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，如白大褂、隔離服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品應(yīng)嚴(yán)格消毒滅菌，而購(gòu)買的物品需要從正規(guī)的、可靠的渠道購(gòu)買。新買的細(xì)胞應(yīng)檢測(cè)驗(yàn)證后再使用。

操作規(guī)范：對(duì)于常規(guī)操作最好制定規(guī)范，且實(shí)驗(yàn)室人員都要按操作規(guī)范進(jìn)行，不能隨意更改，同時(shí)也是培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)人員的良好操作習(xí)慣。比如，槍頭滴管吸完就不再二次伸入培養(yǎng)基中吸取，一次吸夠足夠量的培養(yǎng)基。加液時(shí)也應(yīng)盡量做到懸空加液，這些都可有效預(yù)防支原體污染和細(xì)胞交叉污染。另外可以的話，一次只操作一株細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞間最好有一點(diǎn)時(shí)間間隔，避免交叉污染。

日常管理制度：則包括環(huán)境及耗材試劑等的使用、清潔、保養(yǎng)等各方面的規(guī)則、方法。還有試劑耗材等的用量、庫(kù)存及采購(gòu)等的管理，包括細(xì)胞樣品的兩級(jí)庫(kù)存管理。對(duì)于不易發(fā)現(xiàn)的污染源，最好定期進(jìn)行檢測(cè)，主要是支原體污染和細(xì)胞交叉污染。

04

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題匯總

新買的細(xì)胞

1.新買的或惠贈(zèng)的細(xì)胞如何處理？

不管買的細(xì)胞、惠贈(zèng)的細(xì)胞，剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測(cè)瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

3.購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見原因可能有：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

復(fù)蘇凍存的細(xì)胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長(zhǎng)或貼附的問題。

細(xì)胞培養(yǎng)用液

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

8.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊走x MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

10.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲(chǔ)存應(yīng)該注意什么？

細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號(hào)試用效果良好后，就可一次購(gòu)入較多同一批號(hào)的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營(yíng)養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏紫色。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。

12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基？

對(duì)于應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離制備細(xì)胞生長(zhǎng)因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無血清培養(yǎng)基。

13.如何選擇正確的血清種類？

圖源：https://www.51xxziyuan.com/53/10434.html

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

15.血清滅活是否必須？

一般情況下不建議。熱滅活是以 56℃，30 分鐘來處理已解凍的血清，因?yàn)榇思訜岵襟E，可以使補(bǔ)體去活化，而補(bǔ)體所參與的反應(yīng)有：溶細(xì)胞活性，平滑肌的收縮，肥大細(xì)胞和血小板組胺的釋放，增強(qiáng)吞噬作用，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化和激活。

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多， 這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是 "小黑點(diǎn)"，常常會(huì)讓研究者 誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37C 環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀 物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。因此除了做免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)一些特定細(xì)胞，如平滑肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，不需要做熱滅活處理。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

17.何時(shí)更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

細(xì)胞傳代

18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？

根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養(yǎng)的首次傳代應(yīng)注意的問題？

細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；

吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷；首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。

21.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長(zhǎng)的重要原因之一。

23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？

多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。

細(xì)胞凍存

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？

因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高包膜對(duì)水的通透性。

25.DMSO 的等級(jí)和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。

26.欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細(xì)胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。–20 ℃ 不可超過 1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細(xì)胞凍存太多會(huì)不會(huì)浪費(fèi)？

每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個(gè)狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用最好凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變