今天我們來看一篇2022年3月8日發(fā)表于BioMed Research International雜志,題為“Molecular Mechanism of Gleditsiae Spina for the Treatment of High-Grade Serous Ovarian Cancer Based on Network Pharmacology and Pharmacological Experiments”的研究論文,該文章通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)、分子對接等方法揭示了Gleditsiae Spina(皂角刺)治療高級漿液性卵巢癌(High-Grade Serous Ovarian Cancer)的靶點和分子機制。
這篇文章的研究套路比較經(jīng)典:
1.篩選有效成分
2.活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析
3.GEO數(shù)據(jù)庫分析HGSC相關(guān)靶點差異表達(dá)基因
4.構(gòu)架活性成分靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)
5.目標(biāo)途徑富集分析
6.靶點與分子對接
7.體外驗證
研究結(jié)果
1.Gleditsiae Spina提取物中的主要化學(xué)成分篩選
作者通過提取Gleditsiae Spina的化合物,根據(jù)LC-MS檢測獲得的各化學(xué)成分保留時間、高分辨率精確分子量、MSn多水平片段信息,結(jié)合提取的離子電流圖和標(biāo)準(zhǔn)品信息、Mzcloud數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn),確定其組成,共鑒定出39個主要組成成分。
圖 1 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS鑒定結(jié)果為Gleditsiae Spina提取物中的主要化學(xué)成分。
2.網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與目標(biāo)預(yù)測
在SwissADME平臺中根據(jù)藥代動力學(xué)和藥物相似性進行篩選,并根據(jù)既往文獻(xiàn)報道進行補充,得到26個活性成分。從PubChem獲得26個選定組分的SDF結(jié)構(gòu),并采用PharmMapper靶標(biāo)預(yù)測模型對上述26個活性成分靶標(biāo)進行預(yù)測。
圖 2 Gleditsiae Spina的活動成分-目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖
“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析。利用Cytoscape 3.7.2繪制和分析了脊柱裂有效成分與其活性靶點之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),共獲得635個節(jié)點(包括609個靶點和26個活性成分)和1090個關(guān)系。
3.卵巢癌相關(guān)靶點搜索
卵巢癌相關(guān)靶點(1483)是從基因表達(dá)綜合(GEO)數(shù)據(jù)庫中確定的。
圖 3 差異表達(dá)基因的火山圖。
4.卵巢癌脊柱裂治療關(guān)鍵靶點的篩查
為了在PPI網(wǎng)絡(luò)中獲取更豐富的節(jié)點-節(jié)點連接信息,對節(jié)點信息傳輸效率進行優(yōu)化,確定在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的目標(biāo),計算上述交叉PPI網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲗傩灾?。通過兩次篩選,共獲得87個重點靶點。
圖 4 脊柱裂治療卵巢癌的關(guān)鍵靶點(a)和PPI網(wǎng)絡(luò)(b)
5.卵巢癌脊柱裂治療的通路富集分析和可視化
采用Metascape平臺對上述87個關(guān)鍵節(jié)點進行基因富集分析,包括GO-BP(生物過程)、GO-CC(細(xì)胞成分)、GO-MF(分子功能)和KEGG通路。
圖 5 用于治療HGSC的脊柱裂關(guān)鍵靶點的GO和KEGG富集的氣泡圖。
6.化合物和核心靶標(biāo)的分子對接和分子動力學(xué)模擬結(jié)果
將兩種核心潛在化合物木犀草素luteolin和染料木黃酮genistein與PIK3CA、CTNNB1、HPSE和AKT14個核心靶點分子對接,獲得受體-配體對接結(jié)果。在九組中,對接評分最高的是木犀草素-HPSE(-8.97 kcal/mol),最低的對接評分是染料木犀草素-HPSE(-7.35 kcal/mol)。這表明所選的潛在核心化合物與靶標(biāo)具有更好的結(jié)合活性。
圖 6化合物與核心靶標(biāo)的分子對接
接下來,選擇染料木黃酮、木犀草素和小檗堿作為網(wǎng)絡(luò)中的核心成分,用AKT1、HPSE和PI3K進行分子動力學(xué)模擬測試。染料木黃酮和木犀草素與配體的結(jié)合迅速穩(wěn)定并繼續(xù)起作用,經(jīng)過短暫的波動,小檗堿與配體的結(jié)合也形成穩(wěn)定狀態(tài)。
圖 7 具有核心靶標(biāo)的化合物的分子動力學(xué)模擬
7.Gleditsiae Spina對卵巢癌治療效果的驗證
接下來,作者進行了體外實驗,以驗證Gleditsiae Spina的潛在治療靶點。進行MTT測定以評估不同濃度Gleditsiae Spina溶液對A2780,SKOV3和HEY癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞IOSE80和SVOG的活力影響。結(jié)果表明,脊柱裂對腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用,但對組織細(xì)胞沒有。為了進一步探索脊柱裂的治療機制,結(jié)合上述KEGG分析數(shù)據(jù),用1.25和2.5 mg/mL的Gleditsiae Spina溶液刺激A2780細(xì)胞24 h,然后進行蛋白質(zhì)提取和分析蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果表明,卵巢癌細(xì)胞中肝素酶1,MMP9,β-連環(huán)蛋白和N-鈣粘蛋白的水平顯著下調(diào),以劑量依賴性方式響應(yīng)Gleditsiae Spina治療。此外,用Gleditsiae Spina處理抑制了與PI3K / AKT / mTOR途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。接下來,作者探討了GS的抗腫瘤作用是否依賴于AKT激酶,向細(xì)胞中加入濃度為2 nM的AKT激酶抑制劑。結(jié)果表明,AKT只是脊柱裂的靶點之一,脊柱裂的抗腫瘤作用部分取決于AKT激酶。
圖 8 細(xì)胞驗證結(jié)果
小結(jié)
在這項研究中,作者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)、分子對接、體外驗證等方法揭示了Gleditsiae Spina治療卵巢癌的靶點和治療的分子機制。這些結(jié)果可為Gleditsiae Spina在卵巢癌治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。