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第一步、選定目標Marker以符合實驗目的

通過查閱相關文獻資料，明確實驗所需選取的Marker及其相互間的邏輯關系（如Marker間的層級關系，以T細胞為例，CD3為“父”，CD4或CD8則為“子”）。

以下列出若干典型細胞標記Marker：

第二步、明確Marker的表達部位

針對細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)的Marker，需對細胞執(zhí)行固定及破膜/破核膜處理。進行細胞質(zhì)或細胞核Marker染色時，應先進行細胞表面Marker的染色，隨后固定并破膜細胞，最后對細胞內(nèi)或核內(nèi)Marker進行染色。在此過程中，細胞表面Marker的染色應盡量避免使用串聯(lián)染料，因為固定步驟可能會對串聯(lián)熒光素產(chǎn)生不利影響。

一般而言，多數(shù)CD分子標記位于細胞表面；IL系列、IFN-γ、TNF-α等則屬于細胞內(nèi)標記；而核內(nèi)染色的典型代表是Foxp3。

在確認Marker表達位置的同時，了解其表達量同樣重要。流式配色的一大基本原則是“強弱結合”，即依據(jù)Marker表達量的強弱來合理搭配熒光素的強弱。

根據(jù)目標細胞類型中相應抗原的表達量，我們通?？蓪⒖乖肿哟笾路譃槿悾?/p>

易于鑒定，陰陽性細胞群區(qū)分明顯，陰陽性峰顯著分離的抗原，如CD3、CD4、CD19等。

易于鑒定，表達水平高且常呈連續(xù)性分布的抗原，例如CD27、CD28、CD45RA、CD45RO等。

表達水平低，可能為激活性Marker或未知但關鍵的抗原，如CD25、STAT5、Foxp3等。

Marker的表達量強弱可參考廠家提供的質(zhì)檢數(shù)據(jù)，但更需結合文獻中具體細胞群體的表達情況進行綜合判斷。

第三步、掌握實驗所用流式細胞儀的具體配置，涵蓋激光器、檢測通道及濾光片等關鍵部件

如前所述，流式細胞儀能同時檢測多種熒光，但這些熒光間可能產(chǎn)生相互干擾。因此，需依據(jù)流式細胞儀的通道配置，來確定可選用的熒光素種類，以便在后續(xù)搭配時有效規(guī)避干擾。若缺乏儀器通道的具體信息，將無法準確選定適用的熒光素，配色工作便如同“無根之木，無源之水”。

在通過儀器通道信息確定了可選熒光素后，還需進一步了解這些熒光素的特性，包括其激發(fā)波長、發(fā)射波長以及與之匹配的濾光片等信息，確保它們與流式細胞儀的通道設置相匹配。

第四步、掌握熒光素的強度特性

以下表格列出了常見熒光素的強度等級：

在明確了Marker的表達強弱以及流式細胞儀可檢測的熒光素強度后，我們應遵循“強弱搭配”的原則來進行配色。對于強表達的抗原，既可選擇弱熒光素，也可選用強熒光素。

例如，強表達的抗原CD3，無論選擇弱熒光素FITC還是強熒光素APC，對實驗結果的影響均不顯著。

然而，對于弱表達的抗原，則必須選擇強熒光素以確保檢測的準確性。

以弱表達的抗原CD25為例，若選擇弱熒光素PerCP，可能導致陰陽性細胞群無法有效區(qū)分。而若選用強熒光素PE，則能清晰地觀察到陽性細胞群。

當然，在配色過程中，我們可能還會遇到其他問題，如細胞樣本的自發(fā)熒光、細胞處理過程中死細胞的產(chǎn)生（需額外添加死活細胞染料）等。因此，在配色時，我們應特別注意為這些特殊情況預留相應的熒光檢測通道，以確保實驗的順利進行。相信在掌握了流式配色的基本原則及操作步驟后，大家的實驗將能更加順利地開展。

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