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第一步、選定目標(biāo)Marker以符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，明確實(shí)驗(yàn)所需選取的Marker及其相互間的邏輯關(guān)系（如Marker間的層級(jí)關(guān)系，以T細(xì)胞為例，CD3為“父”，CD4或CD8則為“子”）。

以下列出若干典型細(xì)胞標(biāo)記Marker：

第二步、明確Marker的表達(dá)部位

針對(duì)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)的Marker，需對(duì)細(xì)胞執(zhí)行固定及破膜/破核膜處理。進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核Marker染色時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行細(xì)胞表面Marker的染色，隨后固定并破膜細(xì)胞，最后對(duì)細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)Marker進(jìn)行染色。在此過(guò)程中，細(xì)胞表面Marker的染色應(yīng)盡量避免使用串聯(lián)染料，因?yàn)楣潭ú襟E可能會(huì)對(duì)串聯(lián)熒光素產(chǎn)生不利影響。

一般而言，多數(shù)CD分子標(biāo)記位于細(xì)胞表面；IL系列、IFN-γ、TNF-α等則屬于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記；而核內(nèi)染色的典型代表是Foxp3。

在確認(rèn)Marker表達(dá)位置的同時(shí)，了解其表達(dá)量同樣重要。流式配色的一大基本原則是“強(qiáng)弱結(jié)合”，即依據(jù)Marker表達(dá)量的強(qiáng)弱來(lái)合理搭配熒光素的強(qiáng)弱。

根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型中相應(yīng)抗原的表達(dá)量，我們通常可將抗原分子大致分為三類(lèi)：

易于鑒定，陰陽(yáng)性細(xì)胞群區(qū)分明顯，陰陽(yáng)性峰顯著分離的抗原，如CD3、CD4、CD19等。

易于鑒定，表達(dá)水平高且常呈連續(xù)性分布的抗原，例如CD27、CD28、CD45RA、CD45RO等。

表達(dá)水平低，可能為激活性Marker或未知但關(guān)鍵的抗原，如CD25、STAT5、Foxp3等。

Marker的表達(dá)量強(qiáng)弱可參考廠家提供的質(zhì)檢數(shù)據(jù)，但更需結(jié)合文獻(xiàn)中具體細(xì)胞群體的表達(dá)情況進(jìn)行綜合判斷。

第三步、掌握實(shí)驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀的具體配置，涵蓋激光器、檢測(cè)通道及濾光片等關(guān)鍵部件

如前所述，流式細(xì)胞儀能同時(shí)檢測(cè)多種熒光，但這些熒光間可能產(chǎn)生相互干擾。因此，需依據(jù)流式細(xì)胞儀的通道配置，來(lái)確定可選用的熒光素種類(lèi)，以便在后續(xù)搭配時(shí)有效規(guī)避干擾。若缺乏儀器通道的具體信息，將無(wú)法準(zhǔn)確選定適用的熒光素，配色工作便如同“無(wú)根之木，無(wú)源之水”。

在通過(guò)儀器通道信息確定了可選熒光素后，還需進(jìn)一步了解這些熒光素的特性，包括其激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)以及與之匹配的濾光片等信息，確保它們與流式細(xì)胞儀的通道設(shè)置相匹配。

第四步、掌握熒光素的強(qiáng)度特性

以下表格列出了常見(jiàn)熒光素的強(qiáng)度等級(jí)：

在明確了Marker的表達(dá)強(qiáng)弱以及流式細(xì)胞儀可檢測(cè)的熒光素強(qiáng)度后，我們應(yīng)遵循“強(qiáng)弱搭配”的原則來(lái)進(jìn)行配色。對(duì)于強(qiáng)表達(dá)的抗原，既可選擇弱熒光素，也可選用強(qiáng)熒光素。

例如，強(qiáng)表達(dá)的抗原CD3，無(wú)論選擇弱熒光素FITC還是強(qiáng)熒光素APC，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均不顯著。

然而，對(duì)于弱表達(dá)的抗原，則必須選擇強(qiáng)熒光素以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

以弱表達(dá)的抗原CD25為例，若選擇弱熒光素PerCP，可能導(dǎo)致陰陽(yáng)性細(xì)胞群無(wú)法有效區(qū)分。而若選用強(qiáng)熒光素PE，則能清晰地觀察到陽(yáng)性細(xì)胞群。

當(dāng)然，在配色過(guò)程中，我們可能還會(huì)遇到其他問(wèn)題，如細(xì)胞樣本的自發(fā)熒光、細(xì)胞處理過(guò)程中死細(xì)胞的產(chǎn)生（需額外添加死活細(xì)胞染料）等。因此，在配色時(shí)，我們應(yīng)特別注意為這些特殊情況預(yù)留相應(yīng)的熒光檢測(cè)通道，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。相信在掌握了流式配色的基本原則及操作步驟后，大家的實(shí)驗(yàn)將能更加順利地開(kāi)展。

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1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

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2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

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4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

END

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