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相比于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢具有無創(chuàng)性、敏感性、動(dòng)態(tài)性等特質(zhì)，其出現(xiàn)標(biāo)志著人類在攻克腫瘤癌癥的道路上又前進(jìn)了一大步。因此，在介紹具體的腫瘤基因及分子檢測(cè)技術(shù)之前，先在此簡述液體活檢的基本情況。

液體活檢

■ 液體活檢是什么？

液體活檢是指，在體液樣本中提取分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)分析，為患者的疾病診療提供決策信息。實(shí)際上，從腫瘤取樣角度、相對(duì)組織活檢而言，液體活檢是一類技術(shù)術(shù)語，且正在不斷演化及發(fā)展，并無確切定義。

■ 發(fā)展歷程

■ 范疇

液體活檢的采樣類型包括：血液（外周血）、唾液、尿液、腦脊液、胸腔積液等；

液體活檢分析的分子標(biāo)志物包括：ctDNA、CTC、外泌體（外囊泡的一種）、腫瘤培養(yǎng)的血小板等。根據(jù)美國病理協(xié)會(huì)官網(wǎng)，液體活檢目前的重點(diǎn)是 ctDNA，其他包括 RNA、CTC、細(xì)胞外囊泡（EV）和腫瘤培養(yǎng)的血小板（TEP）。

■ 應(yīng)用

液體活檢主要基于腫瘤釋放的細(xì)胞及核酸（DNA 和 RNA）來評(píng)估治療反應(yīng)（預(yù)后監(jiān)測(cè)、殘留疾病檢測(cè)）、預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、追蹤與耐藥性相關(guān)的突變、可靶向的驅(qū)動(dòng)突變研究和臨床試驗(yàn)注冊(cè)等，可以應(yīng)用于應(yīng)用于腫瘤分子分型、腫瘤演變及預(yù)后監(jiān)測(cè)等場景。

■ 優(yōu)勢(shì)

在臨床應(yīng)用中，組織活檢通常是腫瘤診斷和治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在兩方面弊端：一是侵入性意味著樣本有時(shí)無法取得，需要考慮腫瘤的位置和患者的狀態(tài)；二是組織樣本的含量低等無法滿足 NGS 等檢測(cè)的要求。

相對(duì)組織活檢，液體活檢的整體優(yōu)勢(shì)主要在于獲得侵入性要小得多，允許頻繁、連續(xù)的采樣，從而持續(xù)追蹤腫瘤發(fā)展及預(yù)后反應(yīng)；另外可以在無法進(jìn)行組織活檢下進(jìn)行液體活檢。

■ 前景

據(jù)美國病理協(xié)會(huì)，短期內(nèi)液體活檢可能更有助于確認(rèn)臨床或放射學(xué)上已明顯病變患者的惡性腫瘤；此外，其是組織活檢不可執(zhí)行情況下的可選方案。

基于已獲批產(chǎn)品，液體活檢也大大加速了新藥研發(fā)的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、臨床試驗(yàn)入組以及伴隨診斷的發(fā)展，在預(yù)后檢測(cè)、復(fù)發(fā)評(píng)估等方面有著巨大的前景，核心挑戰(zhàn)是提高靈敏度。該領(lǐng)域的下一個(gè)挑戰(zhàn)和機(jī)會(huì)是將液體活檢納入常規(guī)癌癥篩查計(jì)劃，以促進(jìn)癌癥早期診斷。

液體活檢包括多種技術(shù)，以下將介紹其中最具代表性的幾種。

熒光定量PCR（qPCR）及數(shù)字PCR（dPCR）

■ 定義及意義

PCR（Polymerase Chain Reactio，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是在體外模擬 DNA 復(fù)制的過程，快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列，又稱為基因的體外擴(kuò)增法。PCR 是生物芯片、測(cè)序等分子檢測(cè)技術(shù)中的基礎(chǔ)技術(shù)，也是一項(xiàng)獨(dú)立的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域是革新式推動(dòng)。

■ 原理及步驟

完成 PCR 過程的基本要素包括：

● DNA 模板：包含目標(biāo)序列的樣本 DNA

● DNA 聚合酶：合成與目標(biāo)序列互補(bǔ)的新 DNA 鏈的酶，如TaqDNA 聚合酶

● 核苷酸：dNTP（A/T/C/G） 或脫氧核苷酸三磷酸，是構(gòu)建新 DNA 鏈的元素

● 逆轉(zhuǎn)錄酶：在逆轉(zhuǎn)錄 PCR中需用逆轉(zhuǎn)錄酶將樣品 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA

■ 類型

■ 實(shí)際應(yīng)用

此類技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用場景極多，例如，對(duì)于類似于慢性骨髓性白血病等血液瘤，qPCR 技術(shù)可以通過檢測(cè)原癌基因易位導(dǎo)致的 BCR/ABL 融合基因的表達(dá)，來確定微量殘余腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)行治療效果評(píng)估和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)。

通過使用帶有突變特異性探針的 dPCR，可以在 cfDNA 中的某些突變開始出現(xiàn)在體液中時(shí)就檢測(cè)到它們。此外，dPCR 的高精度和靈敏度可用于監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展和早期檢測(cè)復(fù)發(fā)。

dPCR 除了可以檢測(cè)點(diǎn)突變，還可用于檢測(cè) CNV。此外，研究顯示， dPCR 檢測(cè) HPV 中 mRNA，對(duì)于組織學(xué)上無腫瘤的淋巴結(jié)中的隱匿性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行臨床評(píng)估有較大的應(yīng)用潛力。

下一代測(cè)序（NGS）

■ 定義

下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）也被稱為大規(guī)模平行測(cè)序（MPS）或高通量測(cè)序（HTS），是一種大規(guī)模、并行、高通量測(cè)序技術(shù)，以可擴(kuò)展性、快速和可及性等特點(diǎn)，來確定基因組或部分核酸（DNA/RNA）序列的排列順序，進(jìn)而分析對(duì)應(yīng)調(diào)控、編碼蛋白質(zhì)等生物體特征。 

■ 類型

從分類上，NGS 包括短讀長測(cè)序及長讀長測(cè)序，短讀長測(cè)序在準(zhǔn)確率及成本上相對(duì)成熟，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床等應(yīng)用，但因?yàn)樽x長短對(duì)于大片段結(jié)構(gòu)變異及復(fù)雜基因組組裝等方面有局限；

長讀長測(cè)序目前主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，臨床應(yīng)用仍在探索中，準(zhǔn)確率及成本仍需優(yōu)化，但很好彌補(bǔ)了 NGS 在長片段檢測(cè)方面的局限?；蚧壅J(rèn)為，在 5-10 年內(nèi)，短讀長和長讀長將在市場上互補(bǔ)共存。未來隨著技術(shù)迭代，極可能會(huì)出現(xiàn)集成 Sanger 測(cè)序、短讀長和長讀長優(yōu)勢(shì)的技術(shù)及工具出現(xiàn)。

■ 優(yōu)勢(shì)

NGS 在納米級(jí)空間內(nèi)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)來擴(kuò)增 DNA（ONT 等不需用到 PCR），基于大規(guī)模平行的反應(yīng)產(chǎn)生巨大數(shù)據(jù)量。單位反應(yīng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量逐年提高，成本超摩爾定律下降，目前全基因組測(cè)序（30x）成本低于 500 美元。極大推動(dòng)了人口級(jí)大規(guī)?；驕y(cè)序基礎(chǔ)研究，對(duì)于將基因技術(shù)應(yīng)用到臨床輔助診斷及伴隨診斷、新藥研發(fā)、病原溯源等作出了重要貢獻(xiàn)。

此外，隨著 PacBio 的 SMRT 技術(shù)優(yōu)化，復(fù)雜物種以及微生物的 de novo 組裝得以突破，推動(dòng)生物多樣性研究；ONT 的 Nanopore 測(cè)序技術(shù)不依賴 PCR，最長讀長超過 4 Mb，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)日趨成熟；其便攜式設(shè)備也讓測(cè)序從實(shí)驗(yàn)室到野外，從地球到太空展開更廣闊的應(yīng)用場景。

■ 局限

盡管優(yōu)勢(shì)很大，NGS 仍存在不少局限性，例如：

● 在癌癥液體活檢仍需提高靈敏度，特別是低濃度樣本和低頻突變；

● 成本和周期仍需優(yōu)化；

● 知識(shí)庫的匱乏使得測(cè)序后序列難以解讀，對(duì)應(yīng)采取的臨床基因 Panel 產(chǎn)品設(shè)計(jì)仍不夠靈活和可擴(kuò)展。

■ 實(shí)際應(yīng)用

NGS 帶來大量物種及大規(guī)模樣本的基因組解析，進(jìn)而與 IT 技術(shù)（生物信息、生物計(jì)算、機(jī)器學(xué)習(xí)）等結(jié)合，革新對(duì)癌癥發(fā)展和進(jìn)展的基礎(chǔ)理解、臨床應(yīng)用以及治療。目前，NGS已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、法醫(yī)、生物多樣性等方面的基礎(chǔ)研究、輔助決策及分析。

免疫組化（IHC）

■ 定義及原理

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）簡稱免疫組化，通過標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位結(jié)合目標(biāo)抗原，通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，可視化相應(yīng)抗原在細(xì)胞內(nèi)及其適當(dāng)?shù)慕M織學(xué)背景的高分辨率分布和定位。

■ 步驟

通過切片機(jī)制作病理切片，與抗體一起培養(yǎng)。抗體結(jié)合位點(diǎn)與標(biāo)記物（如熒光染料、酶、放射性元素或膠體金）相連，在顯微鏡下可視化。IHC 反應(yīng)可以通過放射自顯影來觀察，核心是通過對(duì)細(xì)胞或組織造成最少的損傷來對(duì)大部分 IHC 進(jìn)行染色，并通過使用最少的抗體，在腫瘤分型和腫瘤標(biāo)志物上找到一條路。

■ 優(yōu)勢(shì)與實(shí)際應(yīng)用

由于 IHC 涉及特定的抗原 - 抗體反應(yīng)，且能夠?qū)⒖乖拇嬖谂c其在組織或細(xì)胞中的位置相關(guān)聯(lián)，因此它比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前IHC是在臨床上應(yīng)用最為廣泛的病理診斷技術(shù)，廣泛應(yīng)用于許多醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷，特別是細(xì)胞功能研究和分子病理檢測(cè)。免疫組化檢測(cè)可以診斷來源不明、原發(fā)灶和未知原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的腫瘤，還可以預(yù)測(cè)乳腺癌和前列腺癌的治療反應(yīng)，并進(jìn)行腫瘤的病理學(xué)分型，在腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用上起到重要作用。

質(zhì)譜分析（MS）

■ 定義及原理

質(zhì)譜，即是使樣本中各組分電離，生成不同荷質(zhì)比的離子，經(jīng)電場作用形成離子束進(jìn)入質(zhì)量分析器，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點(diǎn)上，得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量進(jìn)而進(jìn)行組分的定性分析 ; 譜峰強(qiáng)度與化合物含量有關(guān)，據(jù)此進(jìn)行定量分析。

■ 類型

質(zhì)譜分為多種類型，包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）、串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）等。

■ 優(yōu)勢(shì)及實(shí)際應(yīng)用

盡管目前常用技術(shù)可以高精度（即靈敏度和特異性）測(cè)量單個(gè)蛋白質(zhì)，但由于與包括自身抗體在內(nèi)的干擾物質(zhì)（例如甲狀腺球蛋白免疫測(cè)定）的交叉反應(yīng)，某些蛋白質(zhì)檢測(cè)的特異性較低，通過 LC-MS/MS 進(jìn)行免疫捕獲分析可以消除干擾。基于液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行高通量高深度研究，可獲得蛋白質(zhì)表達(dá)譜、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、定量差異蛋白表達(dá)譜及蛋白質(zhì)相互作用信息，應(yīng)用于蛋白標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、功能蛋白和多肽的挖掘、信號(hào)通路和分子機(jī)理機(jī)制研究等。

2000㎡生物實(shí)驗(yàn)室

如有實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題，可咨詢我們

電話：19379182007   

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主營項(xiàng)目

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

END

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