為了研究RNA的功能,通常需要通過逆轉(zhuǎn)錄過程將RNA轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的互補DNA(cDNA)。之后cDNA可通過分子克隆、PCR和測序等技術(shù)做進一步的研究。因此,逆轉(zhuǎn)錄過程是許多RNA實驗研究流程的關(guān)鍵步驟。
逆轉(zhuǎn)錄——reverse transcription,是以RNA為模板合成DNA的過程,合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動方向(RNA到DNA),與轉(zhuǎn)錄過程(DNA到RNA)的方向相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。
分子生物學最初的中心法則認為,DNA轉(zhuǎn)錄成RNA,然后再由RNA翻譯成蛋白質(zhì)。但在上世紀70年代,隨著兩支科研團隊(分別為威斯康星大學的Howard Temin領(lǐng)導的團隊和麻省理工大學David Baltimore領(lǐng)導的團隊)各地獨立發(fā)現(xiàn)了與RNA病毒(逆轉(zhuǎn)錄酶病毒)復制相關(guān)的新酶,這一理論遇到了挑戰(zhàn) 。這些酶可以將病毒RNA基因組轉(zhuǎn)換成互補DNA (cDNA)分子,隨后即可整合到宿主的基因組中。這些酶為RNA依賴性DNA聚合酶,又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。因為它們與核心理論的DNA到RNA流程不同,而是由RNA模板轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。1975年,Temin 和 Baltimore憑借在發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶方面的創(chuàng)舉,獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎(與Renato Dulbecco共同獲得,后者憑借在誘導腫瘤病毒方面的成果獲獎)。
RNA逆轉(zhuǎn)錄原理主要涉及以下幾個關(guān)鍵步驟和概念:
01
逆轉(zhuǎn)錄的定義
RNA逆轉(zhuǎn)錄是將RNA轉(zhuǎn)化為互補DNA(cDNA)的過程。這一過程是許多RNA實驗研究的關(guān)鍵步驟,因為它允許通過分子克隆、PCR和測序等技術(shù)進一步分析cDNA。
02
逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶是一種特定的酶,能夠以RNA為模板合成cDNA。這種酶存在于一些RNA病毒中,如某些逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些病毒的RNA不進行自我復制,而是通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,進而整合到宿主細胞的DNA中。
03
實驗步驟
在實驗中,首先從細胞、組織、血液或植物等樣本中提取RNA。然后,通過特定的化學處理(如使用Trizol)來穩(wěn)定RNA并防止其降解。接著,通過加入反轉(zhuǎn)錄酶和必要的反應(yīng)條件(如溫度、pH值和鹽濃度),在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。
04
注意事項
在逆轉(zhuǎn)錄過程中,需要注意基因組DNA的去除,以避免污染反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。通常,這一過程會在RNA分離過程中加入DNase I,并在RT-PCR前徹底去除,以確保單鏈DNA(如引物和cDNA)的穩(wěn)定性。
2000㎡生物實驗室
如有實驗技術(shù)問題,可咨詢我們
電話:19379182007
網(wǎng)站:http://consurebio.com/
(掃碼添加微信)
主營項目
1
動物實驗
動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等
2
細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株
3
分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4
蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5
病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6
生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標;動植物營養(yǎng)指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7
多組學實驗
基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8
整體課題實驗
方案設(shè)計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿
END
聯(lián)系我們
康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項服務(wù)。
聯(lián)系方式:19379182007
公司官網(wǎng):http://consurebio.com/
公司地址:江西省南昌市南昌縣小藍VR產(chǎn)業(yè)基地D座2樓