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一篇文章讓你搞懂,RNA逆轉(zhuǎn)錄原理

瀏覽:1160 發(fā)表時間:2024-11-14

為了研究RNA的功能,通常需要通過逆轉(zhuǎn)錄過程將RNA轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的互補DNA(cDNA)。之后cDNA可通過分子克隆、PCR和測序等技術(shù)做進一步的研究。因此,逆轉(zhuǎn)錄過程是許多RNA實驗研究流程的關(guān)鍵步驟。

逆轉(zhuǎn)錄——reverse transcription,是以RNA為模板合成DNA的過程,合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動方向(RNA到DNA),與轉(zhuǎn)錄過程(DNA到RNA)的方向相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。

分子生物學最初的中心法則認為,DNA轉(zhuǎn)錄成RNA,然后再由RNA翻譯成蛋白質(zhì)。但在上世紀70年代,隨著兩支科研團隊(分別為威斯康星大學的Howard Temin領(lǐng)導的團隊和麻省理工大學David Baltimore領(lǐng)導的團隊)各地獨立發(fā)現(xiàn)了與RNA病毒(逆轉(zhuǎn)錄酶病毒)復制相關(guān)的新酶,這一理論遇到了挑戰(zhàn) 。這些酶可以將病毒RNA基因組轉(zhuǎn)換成互補DNA (cDNA)分子,隨后即可整合到宿主的基因組中。這些酶為RNA依賴性DNA聚合酶,又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。因為它們與核心理論的DNA到RNA流程不同,而是由RNA模板轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。1975年,Temin 和 Baltimore憑借在發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶方面的創(chuàng)舉,獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎(與Renato Dulbecco共同獲得,后者憑借在誘導腫瘤病毒方面的成果獲獎)。

RNA逆轉(zhuǎn)錄原理主要涉及以下幾個關(guān)鍵步驟和概念:

01

逆轉(zhuǎn)錄的定義  

RNA逆轉(zhuǎn)錄是將RNA轉(zhuǎn)化為互補DNA(cDNA)的過程。這一過程是許多RNA實驗研究的關(guān)鍵步驟,因為它允許通過分子克隆、PCR和測序等技術(shù)進一步分析cDNA。


02

逆轉(zhuǎn)錄酶   

逆轉(zhuǎn)錄酶是一種特定的酶,能夠以RNA為模板合成cDNA。這種酶存在于一些RNA病毒中,如某些逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些病毒的RNA不進行自我復制,而是通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,進而整合到宿主細胞的DNA中。

03

實驗步驟   

在實驗中,首先從細胞、組織、血液或植物等樣本中提取RNA。然后,通過特定的化學處理(如使用Trizol)來穩(wěn)定RNA并防止其降解。接著,通過加入反轉(zhuǎn)錄酶和必要的反應(yīng)條件(如溫度、pH值和鹽濃度),在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。

04

注意事項   

在逆轉(zhuǎn)錄過程中,需要注意基因組DNA的去除,以避免污染反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。通常,這一過程會在RNA分離過程中加入DNase I,并在RT-PCR前徹底去除,以確保單鏈DNA(如引物和cDNA)的穩(wěn)定性。

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