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干貨分享 | get這些常規(guī)細(xì)胞實驗，高分文章穩(wěn)了（上）

細(xì)胞實驗可謂是最基礎(chǔ)也是最重要的實驗體系之一，我們可以通過細(xì)胞實驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)制作基礎(chǔ)疾病模型、了解藥物對細(xì)胞的影響、檢測信號通路……

細(xì)胞的實驗操作就像賽跑，你比別人跑的快，就比別人多發(fā)幾篇SCI…掌握這些常規(guī)細(xì)胞實驗，研究課題也會進(jìn)展得更加順利哦~

細(xì)胞增殖實驗

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問題之一。通過在細(xì)胞中過表達(dá)或干擾某個基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。

1. MTT法：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快捷。

原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

2. CCK-8法:可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析，常用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細(xì)胞。同時結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物雙重染色可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。

但由于抗體分子量大，難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點，此外許多細(xì)胞周期分析的染料都需要dsDNA。這種處理方法也使得同一樣本無法同時進(jìn)行細(xì)胞周期分析。對于植物細(xì)胞等有細(xì)胞壁的分析。采用抗體檢測還需要消化細(xì)胞壁，細(xì)胞壁消化酶常含有一些雜質(zhì)，會導(dǎo)致檢測的可靠性降低，同時BrdU檢測則需要進(jìn)行長時間的孵育——幾個小時甚至過夜。

4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。

細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是腫瘤和發(fā)育研究的重點，同時也是藥理學(xué)研究的熱點。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主結(jié)束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。

細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。

ANNEXIN V-PI法: 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin?V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin?V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

將Annexin?V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin?V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium?Iodide,?PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin?V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。是研究離子通道的最重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）

原理：膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流（pA級）進(jìn)行監(jiān)測記錄的方法。

用場效應(yīng)管運算放大器構(gòu)成的I-V轉(zhuǎn)換器是測量回路的核心部分。在場效應(yīng)管運算放大器的正負(fù)輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位時，由于短路負(fù)端子以及膜片都可等電位地達(dá)到鉗制的目的，當(dāng)膜片微電極尖端與默片之間形成10GΩ以上封接時，其間的分流電流達(dá)到最小，橫跨膜片的電流可100%作為來自膜片電極的記錄電流（lp）而被測量出來。

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主營項目

1

動物實驗

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2

細(xì)胞實驗

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實驗、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4

蛋白實驗

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實驗

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實驗

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實驗

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實驗

方案設(shè)計、整體實驗交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

END

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