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對(duì)于低含量的目的細(xì)胞，知道其大致比例，有助于確定流式分析、分選實(shí)驗(yàn)流程中的許多關(guān)鍵要素，如：

①需要染色的樣本總量

②上流式時(shí)需要采集的細(xì)胞總數(shù)

③配色時(shí)染料的選擇

④分選時(shí)純度、得率、活性和時(shí)長(zhǎng)的權(quán)衡

以下整理了人外周血、小鼠、大鼠各細(xì)胞亞群比例。

這些數(shù)值僅供參考（所有顯示的百分比是每個(gè)樣本中各細(xì)胞亞群占白細(xì)胞總數(shù)的百分比）?？赡軙?huì)因樣品制備、個(gè)體差異和所用動(dòng)物的品系而異。

表1-人外周血各細(xì)胞群比例

表2-小鼠各細(xì)胞群比例

表3-大鼠各細(xì)胞群比例

補(bǔ)充內(nèi)容

關(guān)于需要獲取的事件數(shù)量，建議使用泊松統(tǒng)計(jì)，它定義了給定數(shù)量的事件將在固定的時(shí)間/空間間隔內(nèi)發(fā)生的概率，假設(shè)這些事件將以已知的平均速率發(fā)生，與從先前事件經(jīng)過(guò)的時(shí)間無(wú)關(guān)。

對(duì)于流式的稀有細(xì)胞檢測(cè)：N為總事件數(shù)，R為目標(biāo)細(xì)胞如陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，P為目標(biāo)細(xì)胞比例，則為P = R / N，0≤P≤1。方差定義為：Var（R）= NP（1- P）。標(biāo)準(zhǔn)差SD是方差的平方根，CV是等于1/SD即1 /Var的平方根*100%。應(yīng)用舉例，如檢測(cè)PBMC中的B細(xì)胞，健康個(gè)體中，CD19+B細(xì)胞比例為10％左右，因此：P = 0.1，N=5000時(shí)，計(jì)算得CV=4.71％，一般建議CV保持在5％以下，因此獲得5 000個(gè)事件也已足夠。若獲取10000個(gè)總事件，則CV=3.33％。保持達(dá)到一定的CV值，目標(biāo)細(xì)胞比例越低，需要獲取的總事件數(shù)越多。

圖1. 0.01％的稀有細(xì)胞群體的事件數(shù)量示例

下圖顯示了特定細(xì)胞稀有度比例對(duì)應(yīng)的變異系數(shù)（CV）值。CV與陽(yáng)性事件的數(shù)量有關(guān)，并定義為標(biāo)準(zhǔn)偏差 /平均值。

圖2. 特定細(xì)胞稀有度比例對(duì)應(yīng)的變異系數(shù)（CV）值

通常，更低的CV代表更好的實(shí)驗(yàn)精確度和可重復(fù)性。使用此表，如果可以接受較寬的CV，則細(xì)胞比例為0.1％的10,000個(gè)事件就足夠了。但是，CV為10％時(shí)需要100次陽(yáng)性事件，現(xiàn)在您可以看到10,000個(gè)事件數(shù)只有當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞比例在1％以上的范圍內(nèi)CV值才能達(dá)到比較好的狀態(tài)（<5%）。對(duì)于非常稀有的細(xì)胞群體（萬(wàn)分之一乃至十萬(wàn)分之一），要達(dá)到10％的CV就需要收集100萬(wàn)甚至1000萬(wàn)個(gè)事件。若以每秒10,000個(gè)事件的速度進(jìn)行收集，收集1000萬(wàn)個(gè)事件將花費(fèi)1000秒即16分鐘。

圖3.假設(shè)下游應(yīng)用需要100,000個(gè)細(xì)胞，則此圖表可以幫助您基于液滴頻率和細(xì)胞群比例來(lái)確定分選所需的起始細(xì)胞數(shù)量及所要花費(fèi)的時(shí)間。

細(xì)胞頻率也是選擇熒光基團(tuán)時(shí)的一個(gè)因素。對(duì)于低密度抗原，建議選擇明亮的熒光基團(tuán)，但對(duì)于稀有細(xì)胞，也建議選擇明亮的熒光團(tuán)，因?yàn)殛幮匀后w中的背景染色可能會(huì)掩蓋其熒光。最后，在進(jìn)行細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞群的頻率可能會(huì)影響分選。將需要有足夠的起始材料來(lái)為下一次實(shí)驗(yàn)分選足夠數(shù)量的細(xì)胞。此外，細(xì)胞頻率也會(huì)影響收集足夠細(xì)胞所需的時(shí)間；如果對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選所需的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則可能需要降低純度。

圖4.人血細(xì)胞染色。用CD3-PE-A750、CD4-PE、CD8-PE-A647、CD127-A647和CD25-FITC染色10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，鑒定CD4陽(yáng)性的T調(diào)節(jié)細(xì)胞。門控策略顯示，即使收集了100,000個(gè)事件，但在應(yīng)用多個(gè)門控后，最終的群體僅包含992個(gè)細(xì)胞。當(dāng)你增加門的復(fù)雜性時(shí)，收集足夠的細(xì)胞變得更加重要。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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