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在細(xì)胞實驗研究中，驗證細(xì)胞活性是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它關(guān)乎著細(xì)胞在特定條件下（例如藥物處理、放射性或紫外線照射、培養(yǎng)條件調(diào)整等）的生長狀態(tài)。細(xì)胞活性不僅是評估細(xì)胞健康的關(guān)鍵指標(biāo)，也是眾多科研活動的基石。為此，活細(xì)胞分析技術(shù)日益凸顯其重要性。

細(xì)胞活性的檢測方法眾多，其中包括臺盼藍(lán)染色法、熒光染色法、克隆（集落）形成法、ATP含量測定法以及比色法等。

以下是對幾種常用方法的詳細(xì)介紹：

No.1

染色計數(shù)法

01

化學(xué)染色法 

化學(xué)染色法中的染色計數(shù)法是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中用于檢查細(xì)胞死活狀態(tài)的一種常規(guī)且高效的方法。該方法直接依賴于死細(xì)胞與活細(xì)胞對染料親和力的差異來評估細(xì)胞活性，并能夠在光學(xué)顯微鏡下清晰地觀察到染色效果。根據(jù)染料對細(xì)胞的不同作用，此法可細(xì)分為死細(xì)胞著色法與活細(xì)胞著色法兩類。

在死細(xì)胞著色法中，臺盼藍(lán)和苯胺黑是常用的染料；而在活細(xì)胞著色法中，則常采用結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及甲苯胺藍(lán)等染料。其中，臺盼藍(lán)染色法因其高效性和準(zhǔn)確性而最為常用。臺盼藍(lán)作為一種藍(lán)色細(xì)胞活性染料，其特性是無法穿透結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)部，這得益于細(xì)胞膜對通過物質(zhì)的嚴(yán)格選擇性。因此，在活細(xì)胞中，臺盼藍(lán)不會被吸收，而只會滲透進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出獨(dú)特的藍(lán)色。

基于這一原理，臺盼藍(lán)染色法在細(xì)胞實驗中通常與自動細(xì)胞計數(shù)儀或血球計數(shù)板結(jié)合使用，以準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，并同時檢測細(xì)胞膜的完整性。這種方法不僅操作簡便，而且結(jié)果直觀可靠，是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中不可或缺的重要手段。

02

熒光染色法 

此方法利用某些熒光染料對死細(xì)胞與活細(xì)胞的不同作用特性，通過熒光顯微鏡來檢測細(xì)胞活性。例如，碘化丙啶（PI）無法進(jìn)入活細(xì)胞，但能穿透死亡或正在凋亡的細(xì)胞，使這些細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。相反，吖啶橙（AO）能夠穿透質(zhì)膜完整的細(xì)胞，并與細(xì)胞核DNA結(jié)合，發(fā)出明亮的綠色熒光。另一種染料，溴乙錠（EB），則僅能進(jìn)入膜受損的細(xì)胞，與核DNA結(jié)合后發(fā)出橘紅色熒光。此外，AO與EB的聯(lián)合使用（AO-EB雙染法）也是鑒定細(xì)胞死活的有效手段。

在現(xiàn)有的熒光染料中，熒光素二乙酸酯（FDA）及其衍生物，如CFSE，具有獨(dú)特的性質(zhì)。它們本身是非熒光分子，但CFSE能穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后與內(nèi)源酯酶發(fā)生水解反應(yīng)，從而被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。這種熒光產(chǎn)物僅在細(xì)胞膜完整且酯酶活性正常的細(xì)胞中生成并積累，且會隨著細(xì)胞分裂被均勻分配到子細(xì)胞中。因此，利用流式細(xì)胞儀，我們不僅可以分析細(xì)胞的分裂增殖情況，還可以根據(jù)細(xì)胞的完整性對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

No.2

克?。洌┬纬蓪嶒?/strong>

克隆（集落）形成實驗是一種關(guān)鍵技術(shù)，用于評估細(xì)胞的增殖能力、侵襲性以及對殺傷因素的敏感性。該實驗中，細(xì)胞克隆形成率，也即細(xì)胞接種后的存活率，是衡量接種細(xì)胞貼壁后成活并形成克隆數(shù)量的重要指標(biāo)。值得注意的是，并非所有貼壁細(xì)胞都能增殖并形成克隆，唯有那些既貼壁又具有增殖活力的細(xì)胞才能如此。當(dāng)單個細(xì)胞在體外增殖超過6代時，其所形成的細(xì)胞群體即被稱為集落或克隆。通常情況下，每個克隆包含50個或更多的細(xì)胞。通過計算克隆形成率，可以對單個細(xì)胞的增殖潛力進(jìn)行定量分析。

此實驗常用的方法包括平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗。這些技術(shù)在抗腫瘤藥物敏感性試驗和腫瘤放射生物學(xué)試驗中尤為常見。克隆形成率不僅反映了細(xì)胞群體的依賴性，還揭示了其增殖能力這一重要性狀。

No.3

ATP含量測定法

腺苷三磷酸（ATP，adenosine triphosphate）由腺嘌呤、核糖及三個磷酸基團(tuán)構(gòu)成。ATP發(fā)光法是一種通過分析細(xì)胞內(nèi)ATP含量來評估細(xì)胞活性與增殖狀態(tài)的方法。作為活體細(xì)胞最基礎(chǔ)的能量源泉，內(nèi)源性ATP在細(xì)胞死亡時會迅速水解，并經(jīng)歷氧化反應(yīng)釋放出生物冷光。通過光度監(jiān)測，可以測定ATP的含量，其熒光強(qiáng)度與ATP含量成正比。因此，所測熒光強(qiáng)度能夠間接反映出存活細(xì)胞的數(shù)量。

No.4

比色測定法

01

MTT、XTT及CCK-8法 

MTT法，亦稱MTT比色法，是一種評估細(xì)胞存活與生長狀況的技術(shù)。其原理在于，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT還原為不溶于水的藍(lán)紫色甲瓚（Formazan）結(jié)晶，這些結(jié)晶會沉積在細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞則不具備這一能力。隨后，利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞內(nèi)的甲瓚結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀在490nm波長下測定光吸收值，根據(jù)吸光值（OD值）即可推算出活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，吸光值與細(xì)胞活性呈正相關(guān)。但需注意，MTT法對于懸浮細(xì)胞的適用性較差。

XTT與CCK-8均為新合成的四唑氮衍生物，與MTT同屬一類物質(zhì)。它們均能被活細(xì)胞線粒體中的脫氧酶降解，生成棕黃色的水溶性甲腿，可直接通過光譜吸收測定OD值，從而評估細(xì)胞的生長情況。在電子耦合劑的作用下，它們的還原反應(yīng)會得到增強(qiáng)，進(jìn)而提高反應(yīng)的靈敏度。與MTT法相比，這些方法的主要優(yōu)勢在于其反應(yīng)產(chǎn)物為水溶性，無需使用裂解液溶解沉淀，也無需吸取上清，因此既適用于貼壁生長的細(xì)胞，也適用于懸浮生長的細(xì)胞。此外，這些方法還縮短了檢測時間，簡化了處理步驟，并顯著提高了實驗的敏感性。

02

乳酸脫氫酶(LDH)釋放法 

LDH是活細(xì)胞胞漿內(nèi)的重要酶類之一。當(dāng)細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜的通透性會發(fā)生變化，導(dǎo)致LDH被釋放到培養(yǎng)液中。因此，培養(yǎng)液中LDH的活性與被裂解的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。在LDH催化的酶促反應(yīng)中，乳酸被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時氧化型輔酶I (NAD+) 被還原為還原型輔酶I (NADH2)。隨后，NADH2通過遞氫體——吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)，生成有色的甲臢類化合物。利用酶標(biāo)儀檢測其光密度(OD)值，經(jīng)過計算即可得出NK細(xì)胞的活性。

與結(jié)晶紫染色法和MTT比色法相比，LDH釋放法在靈敏度、重復(fù)性和相關(guān)性方面表現(xiàn)出色。該方法簡便易行，靈敏度高，且在敏感性、客觀性、試劑成本及測定速度等方面均優(yōu)于結(jié)晶紫染色法和MTT比色法。

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