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一、qPCR 實(shí)驗(yàn)前期籌備

（一）RNA模板要求

實(shí)驗(yàn)啟動前，需確保RNA模板的純度、濃度及完整性均符合標(biāo)準(zhǔn)，方可推進(jìn)后續(xù)步驟。具體要求如下：

①RNA需保持一級結(jié)構(gòu)完好無損。

②高純度：無DNA、游離核苷酸等核酸雜質(zhì)；無酶抑制性有機(jī)溶劑、金屬離子及蛋白質(zhì)、多糖、脂類等污染物。

③足夠濃度：需滿足反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的基本需求。

（二）qPCR引物設(shè)計(jì)規(guī)范

引物建議長度介于18~30個(gè)堿基；GC含量應(yīng)控制在40%~60%之間；設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)跨越內(nèi)含子，避免內(nèi)部出現(xiàn)互補(bǔ)序列。通常，引物終濃度設(shè)為0.2μM效果較佳；若反應(yīng)效果不佳，可在0.1~1.0μM范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整引物濃度。

二、實(shí)驗(yàn)規(guī)劃——內(nèi)參基因選定

內(nèi)參基因，又稱管家基因，其表達(dá)水平恒定，不受內(nèi)源及外源因素干擾。此類基因高度保守，于各類細(xì)胞與組織間穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)量無明顯差異。在進(jìn)行qPCR相對定量時(shí)，內(nèi)參基因不可或缺，常用者如GAPDH、β-actin及18s rRNA等。

內(nèi)參基因功能概述：

? 消除終產(chǎn)物定量誤差

? 校正樣本加載量偏差

? 抵消PCR抑制物干擾

? 平衡cDNA合成效率差異

內(nèi)參基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：

? 不與目的基因擴(kuò)增相干擾

? 表達(dá)水平適中，避免過高或過低

? 于各類細(xì)胞與組織間表達(dá)穩(wěn)定，量無顯著差異

? 表達(dá)與細(xì)胞周期及活化狀態(tài)無關(guān)

? 完全獨(dú)立于內(nèi)源及外源因素，包括實(shí)驗(yàn)處理影響

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——陽性/陰性對照

在規(guī)劃qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，為確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，避免模板污染、操作失誤等導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)失敗，必須設(shè)置陰性與陽性對照組。

陽性(+)對照組設(shè)置：

可選用含PCR擴(kuò)增子的合成RNA/cDNA寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、克隆重組質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄RNA、特定生物樣本的RNA/DNA，或國際公認(rèn)的生物標(biāo)準(zhǔn)品等作為陽性對照。此對照有助于迅速診斷實(shí)驗(yàn)失敗原因，究竟是試劑失效還是儀器故障。

陰性(-)對照組設(shè)置：

四、數(shù)據(jù)分析——△△Ct法

PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)，模板Ct值與其起始濃度對數(shù)呈線性關(guān)聯(lián)，起始拷貝數(shù)愈多，Ct值愈小。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對未知樣本進(jìn)行精確定量，進(jìn)而評估基因表達(dá)差異或基因拷貝數(shù)。通常采用2-△△Ct法，實(shí)現(xiàn)目的基因的相對定量測定。

五、數(shù)據(jù)分析——擴(kuò)增與融解曲線解析

1、擴(kuò)增曲線分析

擴(kuò)增曲線應(yīng)呈現(xiàn)平滑S型，需確保所有樣本起始無擴(kuò)增信號，且陰性對照（包括無模板對照NTC與無反轉(zhuǎn)錄對照NRC）無熒光響應(yīng)，即無S型擴(kuò)增曲線，同時(shí)擴(kuò)增起峰時(shí)間需符合預(yù)期。

2、融解曲線分析

融解曲線應(yīng)呈現(xiàn)單一峰值，該峰值對應(yīng)目的產(chǎn)物的特定Tm值，此Tm值與產(chǎn)物種類緊密相關(guān)，不受模板量、引物濃度等外部條件影響。理想的單峰應(yīng)狹窄且尖銳，陰性對照中不應(yīng)出現(xiàn)顯著高峰。

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