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蘇木精-伊紅染色法，簡稱HE染色法，石蠟切片技術里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著紫藍色;伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。

1、嗜酸型&嗜堿性

易于被堿性或酸性染料著色的性質稱為嗜堿性和嗜酸性;而對堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現(xiàn)象稱為中性。

1)嗜堿性

嗜堿性是指組織和細胞內酸性物質成分對堿性染料(含有陽離子著色基團的染料，如蘇木精、結晶紫、美藍等)具有親和性。

2、蘇木精&伊紅

1)蘇木精

由蘇木中提取的一種酚類化合物。是細胞學中常用的染色劑，常與伊紅合用。難溶于冷水和乙醚，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。在分析化學中用于比色分析、顯微鏡分析，并用作pH值指示劑，變色范圍5.0-6.0，由黃色變紫色。

蘇木精為堿性染料，將細胞核染為藍色;在水溶液中，特別是在堿溶液中易被空氣氧化成紅棕色的氧化蘇木精。

2)伊紅

伊紅是一種化學合成的酸性染料，在水中解離成帶負電荷的陰離子，可以和蛋白質氨基上帶正電荷的陽離子結合，從而使細胞胞漿染成不同程度的紅色或粉紅色，與蘇木素染色液染色形成的藍色細胞核形成鮮明對比，從而使蘇木素伊紅染色成為病理組織切片中最廣泛使用的一種常規(guī)染色方法。

伊紅分水溶性的和醇溶性：水溶性伊紅，易溶于水，溶液呈綠色熒光，能溶于醇。組織學用于上皮細胞、肌肉纖維和細胞漿染色。醇溶性伊紅，能溶于堿，微溶于乙醇，不溶于水。吸附指示劑，檢測F離子，定量分析滴定溴離子和碘離子。

3、細胞染色

1)細胞核染色

蘇木精為堿性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內染色質的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。

由于組織或細胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細胞核及鈣鹽粘液等呈藍色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍，如處理適宜，可使細胞核著清楚的深藍色，胞漿等其它成分脫色。

2)細胞漿染色

細胞漿內主要成分是蛋白質，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系，當pH調到蛋白質等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或堿性染料不易染色。當pH調到6.7-6.8時，大于蛋白質的等電點pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。

因此必須把pH調至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽離子)，就可被帶負電荷(陰離子)的染料染色。伊紅是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷(陽離子)結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

二、染色程序

1、染色步驟

①石蠟溶解：將切片置于70℃原位雜交儀中，烤片30min。

②脫蠟：將烤過后的切片迅速放入二甲苯中，2次，各5min。

③梯度水化：100%、90%、80%、70%的乙醇中各放置5min，蒸餾水放5min。

④核染：把水吸干，滴加蘇木精染色液，染色5min，流水沖洗掉蘇木素染液，顯微鏡觀察染色程度。

⑤分化：1%鹽酸酒精分化1-3s，水洗，浸入氨水中直至部分變成藍色后，水洗;顯微鏡觀察顏色，若顏色不夠深可直接滴加蘇木素染色液染色1min后，再次分化立即水洗;若過深則適當增加分化時間。

⑥復染：滴加0.5%伊紅染液1滴，染色10-15s，蒸餾水清洗后顯微鏡觀察。

⑦梯度脫水：80%、90%、95%和100%乙醇進行脫水。

⑧透明：浸入二甲苯2次，各5min，室溫晾干。

⑨封片：滴加一滴中性樹膠于組織上，蓋玻片封片。24h后置于顯微鏡下觀察拍照。

2、原理

1)分化作用

染色后，用某些特定的溶液將組織過多結合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。

在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結構，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細胞核過多結合的蘇木精染料和細胞漿吸附的蘇木精染料脫去，再進行伊紅染色，才能保證細胞核與細胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關鍵的一步。

2)返藍作用

分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍色離子狀態(tài)，呈藍色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水(0.2%氨水)使蘇木精染上的細胞核呈現(xiàn)藍色，這個過程稱為返藍作用或藍化作用。

另外用自來水浸洗也可使細胞核返藍，但所需時間較長。

3、試劑

①蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過濾。

②伊紅染液：稱取0.5g水溶性伊紅染液，溶于100ml蒸餾水中。或醇溶性伊紅0.5 g，80%酒精100ml。

③1%鹽酸酒精分化液：按體積比為濃鹽酸：無水乙醇 = 1:99配制。

4、注意事項

①染色時調節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長， 組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

②切片染蘇木精后，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚(晰)而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。

③切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

④在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響細胞形態(tài)。切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

⑤最后封固時，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。

三、結果的判斷和異常分析

1、實驗結果

細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

著色情況與組織或細胞的種類有關，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當其衰老時或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時，伊紅著色由淺變深。

2、異常結果

①紅藍失調：若整體偏藍，可能由于蘇木素染色時間過長、分化不夠，或伊紅失效，伊紅染色時間太短，分化過度;若整體偏紅，可能由于蘇木素染色時間不夠，分化過度，脫蠟不充分，蘇木素染不上，伊紅染色時間過長，分化不夠?？筛鶕?jù)具體原因調整各步驟時間及更換試劑。

②HE染色后出現(xiàn)的大白色斑塊或斑點：脫蠟不充分，可適當增加脫蠟時間以及更換新鮮的二甲苯。

③細胞核染色過淺：蘇木素染色時間過短，或蘇木素失效，或分化時間太長?？芍匦氯旧?，將組織切片放入0.01%氫氧化鈉、0.5%氨水、飽和的碳酸氫鈉溶液、乙醇溶液，每個 3-5min，接著重新染色?？梢赃m當增強組織的嗜堿性以增強核染色，如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氫鈉溶液中3h，自來水沖洗5-10min染色，或Bouin液固定的切片可放入 5%碳酸氫鈉溶液中1h，自來水沖洗10min染色。

④細胞核染色過深，胞漿著藍色：蘇木素染色時間過長，或切片太厚，或分化時間太短。這種情況首先鏡下看看切片厚度(最佳厚度 1~2 層細胞核)，要么重新染色，要么重新制片。

⑤細胞核呈棕紅色改變：蘇木素染液失效;或蘇木素染色后反藍不足。應該立即更換蘇木素染色液，或在流動自來水(pH7.5-7.8)，或在稀釋的氨水溶液，或在0.2%碳酸氫鈉中適當浸泡，這些步驟均可一定程度地加強蘇木素染色后的反藍效果。

⑥伊紅染色較淡：伊紅的pH發(fā)生了改變(pH可能已大于5)，或反藍液體未漂洗干凈，殘留后影響胞漿嗜酸性染色，或者切片太薄并且在隨后的脫水步驟停留過久。應檢查伊紅染色液pH，可使用乙酸調至4.6-5.0。根據(jù)具體原因，調整實驗步驟。

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