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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

(1)了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握常用的細(xì)菌鑒定生理生化反應(yīng)試驗(yàn)方法。

(2)了解細(xì)菌碳、氮代謝類型的多樣性及細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。

(3)了解細(xì)菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、IMViC實(shí)驗(yàn)的原理及在腸道菌鑒定中的重要作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理

微生物個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但種類繁多，在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等人類生產(chǎn)生活的領(lǐng)域均有廣泛涉及，涵蓋了有益與有害的眾多種類。

分類是認(rèn)識(shí)、研究客觀事物的一種基本方法，我們要認(rèn)識(shí)、研究和利用種群龐大的微生物資源也必須對(duì)其進(jìn)行分類。根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性)對(duì)微生物進(jìn)行分群歸類，根據(jù)相似性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并對(duì)各個(gè)類群的特征進(jìn)行描述以便查考和對(duì)未被分類的微生物進(jìn)行鑒定。

對(duì)一種未知微生物進(jìn)行分類鑒定，要在獲得該微生物的純培養(yǎng)之后，進(jìn)行一系列必要的鑒定指標(biāo)的測(cè)定，然后對(duì)照權(quán)威的鑒定手冊(cè)進(jìn)行查對(duì)分析。微生物分類鑒定指標(biāo)可從細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性、細(xì)胞組分、蛋白質(zhì)水平、核酸水平這四種水平層次上展開(kāi)，分類依據(jù)包括形態(tài)特征、生理生化特征、生態(tài)習(xí)性、血清學(xué)反應(yīng)、菌反應(yīng)、細(xì)胞壁成分、紅外吸收光譜、GC含量、DNA雜合率、核糖體核糖核酸(rRNA)相關(guān)度、rRNA的堿基順序等。微生物的分類鑒定方法分為傳統(tǒng)的分類鑒定法以及現(xiàn)代分類鑒定法。傳統(tǒng)的微生物分類鑒定法以表型特征為主，以易于觀察、具有相對(duì)穩(wěn)定性的微生物的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及生態(tài)學(xué)特征為依據(jù)。現(xiàn)代微生物分類鑒定法，借助了現(xiàn)代化分析檢測(cè)技術(shù)手段，將表型特征與分子特征相結(jié)合，以細(xì)胞組分和含量、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子特征作為分類鑒定的依據(jù)，鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確可信。

本試驗(yàn)以糖類發(fā)酵試驗(yàn)、部分蛋白質(zhì)、氨基酸及大分子物質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽及氮鹽利用試驗(yàn)為例進(jìn)行微生物生理生化反應(yīng)特征的分類檢測(cè)。各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同、對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供細(xì)菌分類鑒別之用。用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物以鑒別細(xì)菌的種屬，稱為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。

1.糖發(fā)酵試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但因細(xì)菌所含的酶系不同，所以它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大差異，其發(fā)酵糖以后的代謝產(chǎn)物亦不相同。可產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

糖發(fā)酵試驗(yàn)在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要。不同腸道菌分解糖類的能力和代謝產(chǎn)物不同。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)可初步鑒別腸道致病菌和腸道條件致病菌。腸道致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖腸道條件致病菌多數(shù)發(fā)酵乳糖。例如臨床上對(duì)疑似有大腸桿菌或者傷寒沙門(mén)菌等細(xì)菌感染患者的樣本進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)大腸桿菌能進(jìn)行乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而傷寒沙門(mén)菌則不能發(fā)酵乳糖;進(jìn)行葡萄糖試驗(yàn)檢測(cè)，大腸桿菌有甲酸脫氫酶，能將葡萄糖發(fā)酵生成的甲酸進(jìn)一步分解為CO2,和H2,，結(jié)果為產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;而傷寒沙門(mén)菌缺乏甲酸脫氫酶，發(fā)酵葡萄糖后則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

糖發(fā)酵試驗(yàn)細(xì)菌代謝產(chǎn)物中酸的產(chǎn)生可利用培養(yǎng)基中溴甲酚紫的顏色變化進(jìn)行判斷，澳甲酚紫指示劑變色范圍為pH5.2(黃色)~pH6.8(紫色)。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管內(nèi)倒置的杜氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)判斷。

2.吲哚試驗(yàn)

IMViC試驗(yàn)是吲哚(I)試驗(yàn)、甲基紅(M)試驗(yàn)、伏-普(V)試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用(C)試驗(yàn)合稱的縮寫(xiě)，常用于鑒定腸道桿菌，特別是用于鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌。多用于水的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，尤其對(duì)形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和培養(yǎng)特性相同或相似的細(xì)菌的檢驗(yàn)尤為重要。

吲哚試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)菌是否具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質(zhì))的能力。有些細(xì)菌如大腸桿菌能產(chǎn)生色氨酸水解酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸，吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，生成玫瑰吲哚(紅色化合物)為陽(yáng)性反應(yīng)，而產(chǎn)氣桿菌為陰性反應(yīng)。

3.甲基紅試驗(yàn)(M.R或M試驗(yàn))

甲基紅試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)菌能否分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸的能力。很多細(xì)菌（如大腸桿菌）分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步反應(yīng)形成甲酸、乙酸、乳酸等有機(jī)酸，此時(shí)若加入甲基紅指示劑，則會(huì)使發(fā)生顏色變化。甲基紅指示劑變色范圍pH4.4(紅色)~pH6.2(黃色)。當(dāng)培養(yǎng)基pH降低到4.4以下時(shí)，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，此為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。有些細(xì)如產(chǎn)氣桿菌在培養(yǎng)的早期產(chǎn)生有機(jī)酸，但在后期將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇丙酮酸等，使pH升至6左右，此時(shí)加人甲基紅指示劑呈黃色，為陰性反應(yīng)。

4.VP試驗(yàn)(Voges-Proskauer 試驗(yàn)，伏-普試驗(yàn))

伏-普試驗(yàn)是用來(lái)測(cè)定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖成丙酮酸，再將丙酮酸縮合脫羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下被氧化為二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基中蛋白胨精氨酸的胍基反應(yīng)，生成紅色化合物，此為VP反應(yīng)陽(yáng)性。大腸桿菌不產(chǎn)生紅色化合物，為陰性反應(yīng)。若在培養(yǎng)基中加入a-萘酚或少量肌酸(0.3%)、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反應(yīng)。本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榧谆t試驗(yàn)呈陽(yáng)性的細(xì)菌，VP試驗(yàn)通常為陰性。

5.檸檬酸鹽試驗(yàn)

檸檬酸鹽試驗(yàn)用于檢測(cè)腸桿菌科各屬細(xì)菌能否利用檸檬酸的能力。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能夠利用銨鹽作為唯一氮源，利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，則能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。細(xì)菌分解利用檸檬酸鹽產(chǎn)生CO2,，CO2,與培養(yǎng)基中的Na+、H2O結(jié)合形成碳酸鈉，碳酸鈉與細(xì)菌利用銨鹽產(chǎn)生的氨反應(yīng)，形成NH4OH，從而使培養(yǎng)基呈現(xiàn)堿性，使變色范圍為pH6.0(黃色)~pH7.6(藍(lán)色)的溴香草酚藍(lán)指示劑由綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，此為檸酸鹽反應(yīng)陽(yáng)性。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌如大腸桿菌，在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。

6.硫化氫試驗(yàn)

某些細(xì)菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產(chǎn)生硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成硫化鉛或硫化鐵黑色沉淀，為硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，黑色沉淀物愈多，表示生成的疏化氫量亦愈多。硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基中含有硫代硫酸鈉，作為一種還原劑，能保持培養(yǎng)基中生成的硫化氫不再被氧化。

硫化氫試驗(yàn)主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。沙門(mén)菌屬、愛(ài)德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬的細(xì)菌，絕大多數(shù)呈硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，其他菌屬多為陰性沙門(mén)菌屬中也有硫化氫陰性菌種。如產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，大腸桿菌硫化氫試驗(yàn)陰性。

7.明膠液化試驗(yàn)

明膠是膠原水解產(chǎn)物，是生物來(lái)源的多肽，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體狀態(tài)存在，而在25℃以上時(shí)明膠就會(huì)液化。某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶--明膠酶。明膠酶能分解明膠生成氨基酸，從而使明膠失去凝固力，半固體明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體培養(yǎng)基。有的甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。明膠液化試驗(yàn)可用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等能液化明膠，多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。

8.淀粉水解試驗(yàn)

細(xì)菌不能直接利用大分子的淀粉，須將淀粉水解為小分子物質(zhì)后才可吸收利用。某些細(xì)菌可產(chǎn)生胞外淀粉酶，將淀粉水解后產(chǎn)生糊精或進(jìn)一步水解為雙糖或單糖后使其運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)。細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉的過(guò)程可通過(guò)底物的變化來(lái)證明，即加碘液測(cè)定時(shí)不再產(chǎn)生藍(lán)色。

9.硝酸鹽還原試驗(yàn)

硝酸鹽還原(nitratereduetion)是生物體內(nèi)的一種氧化還原反應(yīng)，即硝酸鹽在硝酸還原酶的作用下，還原成亞硝酸的反應(yīng)。一般指有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取８窭锼乖噭┛捎糜谔卣餍詸z驗(yàn)亞硝酸根:產(chǎn)生的亞硝酸鹽與Z酸反成生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氨基苯磺酸:生成的重氨基苯磺酸與α-萘胺結(jié)合生成N-α萘胺偶苯磺酸(紅色化合物)，表明細(xì)菌能還原硝酸鹽產(chǎn)生亞硝酸鹽，此為硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。格里斯試劑A液為對(duì)氨基苯磺酸加乙酸，格里斯試劑B液為α-萘胺。

硝酸鹽還原試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定，腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。硝酸鹽還原過(guò)程可因細(xì)菌不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸桿菌等:有的細(xì)菌則可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨:有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽還原試驗(yàn)要排除干擾，由于亞硝酸鹽在自然界廣泛分布，容易污染試劑，因此只有對(duì)照管陰性時(shí)，才能根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷。硝酸鹽的存在可用二苯胺試劑檢驗(yàn)。在酸性條件下，二苯胺經(jīng)硝酸氧化后呈氧化態(tài)的顏色即深藍(lán)色或紫色(圖1)。

圖1

三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱、試管、無(wú)菌培養(yǎng)皿、杜氏小管、接種環(huán)、酒精燈。

2.微生物材料

大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌斜面

3.培養(yǎng)基

(1)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

(2)乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(乳糖發(fā)酵試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

(3)胰蛋白水培養(yǎng)基(吲哚試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

(4)葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基(甲基紅試驗(yàn)和VP試驗(yàn)):每組6支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中2支試管分別作為甲基紅試驗(yàn)和VF試驗(yàn)的陰性對(duì)照，另外4支用于接種細(xì)菌，甲基紅試驗(yàn)和VP試驗(yàn)各2支。

(5)檸檬酸鈉固體培養(yǎng)基(檸檬酸鹽利用試驗(yàn)):每組3支試管，5~10mL/管，培養(yǎng)基配制好分裝于試管后滅菌，滅菌完成擺成斜面?zhèn)溆谩Ｔ嚬苌蠘?biāo)明培養(yǎng)基名稱，其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

(6)檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基(硫化氫試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌

(7)明膠培養(yǎng)基(明膠液化試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL，試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

(8)淀粉固體培養(yǎng)基(淀粉水解試驗(yàn)):每組60mL，滅菌后倒于3個(gè)平板，15~20mL/皿，平板上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1個(gè)平板試管作為陰性對(duì)照，另外2個(gè)平板用于接種細(xì)菌。

(9)硝酸鹽培養(yǎng)基(硝酸鹽還原試驗(yàn)):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL試管上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對(duì)照，另外2支用于接種細(xì)菌。

4.實(shí)驗(yàn)用具

試管、杜氏小管、接種針、接種環(huán)、酒精燈、火柴、試管架、記號(hào)筆。

5.實(shí)驗(yàn)試劑

甲基紅試劑、VP試劑、吲哚試劑、格里斯試劑(A、B)、盧戈氏碘液。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)

(1)接種:取3支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，其中1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，留下1支不接種作為陰性對(duì)照管。試管上標(biāo)明所接種的菌名和組號(hào)。

(2)培養(yǎng):將已接種好的試管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(3)結(jié)果觀察:

產(chǎn)酸產(chǎn)氣:細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中指示劑呈酸性反應(yīng)，呈現(xiàn)黃色:倒置的杜氏小管中產(chǎn)生氣體(氣體占杜氏小管的10%以上)。

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸但不產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，杜氏小管中無(wú)氣泡產(chǎn)生。

不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:若被測(cè)細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的葡萄糖，則培養(yǎng)基顏色仍為紫色，不發(fā)生變化，且杜氏小管中無(wú)氣泡產(chǎn)生。

2.乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

(1)接種:取3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，其中1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，留下1支不接種作為陰性對(duì)照管。試管上標(biāo)明所接種的菌名和組號(hào)。

(2)培養(yǎng):將已接種好的試管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(3)結(jié)果觀察:

產(chǎn)酸產(chǎn)氣:細(xì)菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中指示劑呈酸性反應(yīng)，呈現(xiàn)黃色;倒置的杜氏小管中產(chǎn)生氣體(氣體占杜氏小管的10%以上)

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:細(xì)菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸但不產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，杜氏小管中無(wú)氣泡產(chǎn)生。

不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:若被測(cè)細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的乳糖，則培養(yǎng)基顏色仍為紫色，不發(fā)生變化，且杜氏小管中無(wú)氣泡產(chǎn)生。

3.吲哚試驗(yàn)

(1)接種:取3支胰蛋白胨水培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種留作陰性對(duì)照。試管上標(biāo)明所接種的菌名和組號(hào)。

(2)培養(yǎng):37 ℃培養(yǎng) 24~48h。

(3)結(jié)果觀察:沿試管壁緩慢滴加幾滴吲哚試劑，注意不要搖動(dòng)試管，使試劑浮于培養(yǎng)液上層。兩液交界面處呈現(xiàn)玫瑰紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。

4.甲基紅試驗(yàn)

(1)接種:取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管。1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種留作陰性對(duì)照。試管上標(biāo)注所接種的菌名和組號(hào)。

(2)培養(yǎng):37℃恒溫培養(yǎng)48h。

(3)觀察結(jié)果:加入甲基紅指示劑數(shù)滴。培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。

5.VP 試驗(yàn)

(1)接種:取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種作為陰性對(duì)照。

(2)培養(yǎng):37℃培養(yǎng)48h取出。

(3)觀察結(jié)果:培養(yǎng)結(jié)束后，往試管培養(yǎng)液中加人5~10滴40%KOH，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩試管，再放人37℃培養(yǎng)箱中保溫15~30min 加快反應(yīng)速度若培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，則為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。

6.檸檬酸鹽利用試驗(yàn)

(1)接種:取3支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌1支不接種作為陰性作對(duì)照。

(2)培養(yǎng):37 ℃培養(yǎng)24 h。

(3)觀察結(jié)果:與陰性對(duì)照比較，如果斜面上有細(xì)菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性結(jié)果;若培養(yǎng)基不變色，繼續(xù)培養(yǎng)5~7天，培養(yǎng)基仍不變色保持綠色則為陰性。

7.硫化氫試驗(yàn)

(1)接種:取3支檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基試管，采用管壁穿刺接種法接種(即無(wú)菌接種針挑取菌種后沿著試管管壁穿刺接種)，1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，1支不接種作為陰性對(duì)照。

(2)培養(yǎng):接種好的試管培養(yǎng)物置于37℃培養(yǎng)24h。

(3)觀察結(jié)果:試管培養(yǎng)基中若出現(xiàn)黑色沉淀線為陽(yáng)性。培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮浴?/p>

8.明膠液化試驗(yàn)

(1)接種:取3支營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基試管，用穿刺接種法接種，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌，1支不接種作為陰性對(duì)照。

(2)培養(yǎng):37℃培養(yǎng)48h。

(3)觀察結(jié)果:觀察明膠的液化情況。若室溫較高，培養(yǎng)基自行熔化時(shí)，可將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4℃冰箱30min，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固表明明膠已被細(xì)菌液化，此為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性。

9.淀粉水解實(shí)驗(yàn)

(1)接種:淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，無(wú)菌操作制成平板。平板冷卻后，取3個(gè)平板，用無(wú)菌接種環(huán)在1個(gè)平板上劃線接種(蛇形劃線)枯草桿菌，在另1個(gè)平板上劃線接種大腸桿菌(蛇形劃線)，另1個(gè)平板不接種作為陰性對(duì)照。

(2)培養(yǎng):接種后平板置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h。

(3)觀察結(jié)果:打開(kāi)培養(yǎng)皿，將盧戈氏碘液逐滴滴加于平板上，輕輕搖動(dòng)平皿，使碘液均勻布滿平板。如菌苔周圍有透明圈出現(xiàn)，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶，淀粉已被水解。相對(duì)于菌落直徑，透明圈越大，說(shuō)明該菌水解淀粉能力越強(qiáng)。

10.硝酸鹽還原試驗(yàn)

(1)接種:取3支硝酸鹽培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌，另1支不接種作為陰性對(duì)照。

(2)培養(yǎng)與觀察:37℃培養(yǎng)18~96h。用無(wú)菌吸管吸取培養(yǎng)物2mL加于試管內(nèi)，加入格里斯試劑A液和B液各1滴，與未接種細(xì)菌的陰性對(duì)照管相比較，立即或10min內(nèi)觀察結(jié)果。若出現(xiàn)粉紅色、玫瑰色、橙色或棕色，則表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原試驗(yàn)。

陽(yáng)性。加入格里斯試劑后未出現(xiàn)紅色反應(yīng)的培養(yǎng)物，用二苯胺試劑檢驗(yàn)硝酸鹽的存在。傾斜試管，沿管壁慢慢滴入二苯胺試劑1~2滴，如培養(yǎng)液呈現(xiàn)藍(lán)色，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在而未被還原，無(wú)亞硝酸鹽存在，此為硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。若加人格里斯試劑后未出現(xiàn)紅色變化的培養(yǎng)物，用二苯胺試劑檢驗(yàn)仍無(wú)顏色反應(yīng)(無(wú)藍(lán)色出現(xiàn))，表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都被還原成其他物質(zhì)，該菌具有硝酸鹽還原作用，按硝酸鹽還原陽(yáng)性處理。由于繁殖迅速、硝酸鹽還原能力強(qiáng)的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久可能將亞硝酸鹽全部分解成為氨氣和氮?dú)?，故須每天進(jìn)行結(jié)果檢驗(yàn)。

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