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蘇木精-伊紅染色法，簡(jiǎn)稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色;伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

1、嗜酸型&嗜堿性

易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)稱為嗜堿性和嗜酸性;而對(duì)堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現(xiàn)象稱為中性。

1)嗜堿性

嗜堿性是指組織和細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)成分對(duì)堿性染料(含有陽(yáng)離子著色基團(tuán)的染料，如蘇木精、結(jié)晶紫、美藍(lán)等)具有親和性。

2、蘇木精&伊紅

1)蘇木精

由蘇木中提取的一種酚類化合物。是細(xì)胞學(xué)中常用的染色劑，常與伊紅合用。難溶于冷水和乙醚，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。在分析化學(xué)中用于比色分析、顯微鏡分析，并用作pH值指示劑，變色范圍5.0-6.0，由黃色變紫色。

蘇木精為堿性染料，將細(xì)胞核染為藍(lán)色;在水溶液中，特別是在堿溶液中易被空氣氧化成紅棕色的氧化蘇木精。

2)伊紅

伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，可以和蛋白質(zhì)氨基上帶正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合，從而使細(xì)胞胞漿染成不同程度的紅色或粉紅色，與蘇木素染色液染色形成的藍(lán)色細(xì)胞核形成鮮明對(duì)比，從而使蘇木素伊紅染色成為病理組織切片中最廣泛使用的一種常規(guī)染色方法。

伊紅分水溶性的和醇溶性：水溶性伊紅，易溶于水，溶液呈綠色熒光，能溶于醇。組織學(xué)用于上皮細(xì)胞、肌肉纖維和細(xì)胞漿染色。醇溶性伊紅，能溶于堿，微溶于乙醇，不溶于水。吸附指示劑，檢測(cè)F離子，定量分析滴定溴離子和碘離子。

3、細(xì)胞染色

1)細(xì)胞核染色

蘇木精為堿性天然染料，可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。

由于組織或細(xì)胞的不同成分對(duì)蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細(xì)胞核及鈣鹽粘液等呈藍(lán)色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍(lán)，如處理適宜，可使細(xì)胞核著清楚的深藍(lán)色，胞漿等其它成分脫色。

2)細(xì)胞漿染色

細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物、細(xì)胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當(dāng)pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4.7-5.0時(shí)，胞漿對(duì)外不顯電性，此時(shí)酸或堿性染料不易染色。當(dāng)pH調(diào)到6.7-6.8時(shí)，大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負(fù)電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時(shí)胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。

因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點(diǎn)以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽(yáng)離子)，就可被帶負(fù)電荷(陰離子)的染料染色。伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷(陽(yáng)離子)結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。

二、染色程序

1、染色步驟

①石蠟溶解：將切片置于70℃原位雜交儀中，烤片30min。

②脫蠟：將烤過(guò)后的切片迅速放入二甲苯中，2次，各5min。

③梯度水化：100%、90%、80%、70%的乙醇中各放置5min，蒸餾水放5min。

④核染：把水吸干，滴加蘇木精染色液，染色5min，流水沖洗掉蘇木素染液，顯微鏡觀察染色程度。

⑤分化：1%鹽酸酒精分化1-3s，水洗，浸入氨水中直至部分變成藍(lán)色后，水洗;顯微鏡觀察顏色，若顏色不夠深可直接滴加蘇木素染色液染色1min后，再次分化立即水洗;若過(guò)深則適當(dāng)增加分化時(shí)間。

⑥復(fù)染：滴加0.5%伊紅染液1滴，染色10-15s，蒸餾水清洗后顯微鏡觀察。

⑦梯度脫水：80%、90%、95%和100%乙醇進(jìn)行脫水。

⑧透明：浸入二甲苯2次，各5min，室溫晾干。

⑨封片：滴加一滴中性樹(shù)膠于組織上，蓋玻片封片。24h后置于顯微鏡下觀察拍照。

2、原理

1)分化作用

染色后，用某些特定的溶液將組織過(guò)多結(jié)合的染色劑脫去，這個(gè)過(guò)程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。

在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細(xì)胞核過(guò)多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去，再進(jìn)行伊紅染色，才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。

2)返藍(lán)作用

分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，呈藍(lán)色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水(0.2%氨水)使蘇木精染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，這個(gè)過(guò)程稱為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。

另外用自來(lái)水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán)，但所需時(shí)間較長(zhǎng)。

3、試劑

①蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過(guò)濾。

②伊紅染液：稱取0.5g水溶性伊紅染液，溶于100ml蒸餾水中。或醇溶性伊紅0.5 g，80%酒精100ml。

③1%鹽酸酒精分化液：按體積比為濃鹽酸：無(wú)水乙醇 = 1:99配制。

4、注意事項(xiàng)

①染色時(shí)調(diào)節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(zhǎng)， 組織酸化而影響細(xì)胞核著色。因此，要在自來(lái)水中沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細(xì)胞核著色較深。染伊紅時(shí)胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

②切片染蘇木精后，分色這一步是關(guān)鍵，應(yīng)在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細(xì)胞核染色清楚(晰)而細(xì)胞質(zhì)基本無(wú)色為佳。如果過(guò)分延長(zhǎng)分色時(shí)間將導(dǎo)致染色太淺，應(yīng)重新染色后再行分色。

③切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應(yīng)將切片退回?zé)o水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

④在染色過(guò)程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響細(xì)胞形態(tài)。切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應(yīng)擦干凈或吸干多余水分。

⑤最后封固時(shí)，要用中性樹(shù)脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì)褪色，所用樹(shù)脂濃度要適當(dāng)，樹(shù)脂封固時(shí)不能有氣泡。

三、結(jié)果的判斷和異常分析

1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

著色情況與組織或細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，細(xì)胞在新生時(shí)期胞漿對(duì)伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當(dāng)其衰老時(shí)或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時(shí)，伊紅著色由淺變深。

2、異常結(jié)果

①紅藍(lán)失調(diào)：若整體偏藍(lán)，可能由于蘇木素染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、分化不夠，或伊紅失效，伊紅染色時(shí)間太短，分化過(guò)度;若整體偏紅，可能由于蘇木素染色時(shí)間不夠，分化過(guò)度，脫蠟不充分，蘇木素染不上，伊紅染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分化不夠。可根據(jù)具體原因調(diào)整各步驟時(shí)間及更換試劑。

②HE染色后出現(xiàn)的大白色斑塊或斑點(diǎn)：脫蠟不充分，可適當(dāng)增加脫蠟時(shí)間以及更換新鮮的二甲苯。

③細(xì)胞核染色過(guò)淺：蘇木素染色時(shí)間過(guò)短，或蘇木素失效，或分化時(shí)間太長(zhǎng)?？芍匦氯旧瑢⒔M織切片放入0.01%氫氧化鈉、0.5%氨水、飽和的碳酸氫鈉溶液、乙醇溶液，每個(gè) 3-5min，接著重新染色?？梢赃m當(dāng)增強(qiáng)組織的嗜堿性以增強(qiáng)核染色，如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氫鈉溶液中3h，自來(lái)水沖洗5-10min染色，或Bouin液固定的切片可放入 5%碳酸氫鈉溶液中1h，自來(lái)水沖洗10min染色。

④細(xì)胞核染色過(guò)深，胞漿著藍(lán)色：蘇木素染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或切片太厚，或分化時(shí)間太短。這種情況首先鏡下看看切片厚度(最佳厚度 1~2 層細(xì)胞核)，要么重新染色，要么重新制片。

⑤細(xì)胞核呈棕紅色改變：蘇木素染液失效;或蘇木素染色后反藍(lán)不足。應(yīng)該立即更換蘇木素染色液，或在流動(dòng)自來(lái)水(pH7.5-7.8)，或在稀釋的氨水溶液，或在0.2%碳酸氫鈉中適當(dāng)浸泡，這些步驟均可一定程度地加強(qiáng)蘇木素染色后的反藍(lán)效果。

⑥伊紅染色較淡：伊紅的pH發(fā)生了改變(pH可能已大于5)，或反藍(lán)液體未漂洗干凈，殘留后影響胞漿嗜酸性染色，或者切片太薄并且在隨后的脫水步驟停留過(guò)久。應(yīng)檢查伊紅染色液pH，可使用乙酸調(diào)至4.6-5.0。根據(jù)具體原因，調(diào)整實(shí)驗(yàn)步驟。

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