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一、實驗目的

(1)了解細菌生理生化反應原理，掌握常用的細菌鑒定生理生化反應試驗方法。

(2)了解細菌碳、氮代謝類型的多樣性及細菌在不同培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物在鑒別細菌中的意義。

(3)了解細菌糖發(fā)酵實驗、IMViC實驗的原理及在腸道菌鑒定中的重要作用。

二、實驗原理

微生物個體微小、結構簡單，但種類繁多，在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等人類生產(chǎn)生活的領域均有廣泛涉及，涵蓋了有益與有害的眾多種類。

分類是認識、研究客觀事物的一種基本方法，我們要認識、研究和利用種群龐大的微生物資源也必須對其進行分類。根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關性)對微生物進行分群歸類，根據(jù)相似性或相關性水平排列成系統(tǒng)，并對各個類群的特征進行描述以便查考和對未被分類的微生物進行鑒定。

對一種未知微生物進行分類鑒定，要在獲得該微生物的純培養(yǎng)之后，進行一系列必要的鑒定指標的測定，然后對照權威的鑒定手冊進行查對分析。微生物分類鑒定指標可從細胞形態(tài)和習性、細胞組分、蛋白質水平、核酸水平這四種水平層次上展開，分類依據(jù)包括形態(tài)特征、生理生化特征、生態(tài)習性、血清學反應、菌反應、細胞壁成分、紅外吸收光譜、GC含量、DNA雜合率、核糖體核糖核酸(rRNA)相關度、rRNA的堿基順序等。微生物的分類鑒定方法分為傳統(tǒng)的分類鑒定法以及現(xiàn)代分類鑒定法。傳統(tǒng)的微生物分類鑒定法以表型特征為主，以易于觀察、具有相對穩(wěn)定性的微生物的形態(tài)學特征、生理生化特征及生態(tài)學特征為依據(jù)?，F(xiàn)代微生物分類鑒定法，借助了現(xiàn)代化分析檢測技術手段，將表型特征與分子特征相結合，以細胞組分和含量、蛋白質、核酸等生物大分子特征作為分類鑒定的依據(jù)，鑒定結果更為準確可信。

本試驗以糖類發(fā)酵試驗、部分蛋白質、氨基酸及大分子物質代謝試驗、有機酸鹽及氮鹽利用試驗為例進行微生物生理生化反應特征的分類檢測。各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同、對營養(yǎng)基質的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供細菌分類鑒別之用。用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產(chǎn)物以鑒別細菌的種屬，稱為細菌的生理生化反應。

1.糖發(fā)酵試驗

糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但因細菌所含的酶系不同，所以它們在分解糖類物質的能力上有很大差異，其發(fā)酵糖以后的代謝產(chǎn)物亦不相同?？僧a(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

糖發(fā)酵試驗在腸道細菌的鑒定上尤為重要。不同腸道菌分解糖類的能力和代謝產(chǎn)物不同。乳糖發(fā)酵試驗可初步鑒別腸道致病菌和腸道條件致病菌。腸道致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖腸道條件致病菌多數(shù)發(fā)酵乳糖。例如臨床上對疑似有大腸桿菌或者傷寒沙門菌等細菌感染患者的樣本進行糖發(fā)酵試驗檢測，結果可見大腸桿菌能進行乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而傷寒沙門菌則不能發(fā)酵乳糖;進行葡萄糖試驗檢測，大腸桿菌有甲酸脫氫酶，能將葡萄糖發(fā)酵生成的甲酸進一步分解為CO2,和H2,，結果為產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;而傷寒沙門菌缺乏甲酸脫氫酶，發(fā)酵葡萄糖后則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

糖發(fā)酵試驗細菌代謝產(chǎn)物中酸的產(chǎn)生可利用培養(yǎng)基中溴甲酚紫的顏色變化進行判斷，澳甲酚紫指示劑變色范圍為pH5.2(黃色)~pH6.8(紫色)。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管內倒置的杜氏小管中有無氣泡來判斷。

2.吲哚試驗

IMViC試驗是吲哚(I)試驗、甲基紅(M)試驗、伏-普(V)試驗、檸檬酸鹽利用(C)試驗合稱的縮寫，常用于鑒定腸道桿菌，特別是用于鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌。多用于水的細菌學檢驗，尤其對形態(tài)、革蘭染色反應和培養(yǎng)特性相同或相似的細菌的檢驗尤為重要。

吲哚試驗用于檢測細菌是否具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質)的能力。有些細菌如大腸桿菌能產(chǎn)生色氨酸水解酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，生成玫瑰吲哚(紅色化合物)為陽性反應，而產(chǎn)氣桿菌為陰性反應。

3.甲基紅試驗(M.R或M試驗)

甲基紅試驗用于檢測細菌能否分解葡萄糖產(chǎn)生有機酸的能力。很多細菌（如大腸桿菌）分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步反應形成甲酸、乙酸、乳酸等有機酸，此時若加入甲基紅指示劑，則會使發(fā)生顏色變化。甲基紅指示劑變色范圍pH4.4(紅色)~pH6.2(黃色)。當培養(yǎng)基pH降低到4.4以下時，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，此為甲基紅試驗陽性。有些細如產(chǎn)氣桿菌在培養(yǎng)的早期產(chǎn)生有機酸，但在后期將有機酸轉化為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇丙酮酸等，使pH升至6左右，此時加人甲基紅指示劑呈黃色，為陰性反應。

4.VP試驗(Voges-Proskauer 試驗，伏-普試驗)

伏-普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。細菌如產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖成丙酮酸，再將丙酮酸縮合脫羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下被氧化為二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基中蛋白胨精氨酸的胍基反應，生成紅色化合物，此為VP反應陽性。大腸桿菌不產(chǎn)生紅色化合物，為陰性反應。若在培養(yǎng)基中加入a-萘酚或少量肌酸(0.3%)、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反應。本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為甲基紅試驗呈陽性的細菌，VP試驗通常為陰性。

5.檸檬酸鹽試驗

檸檬酸鹽試驗用于檢測腸桿菌科各屬細菌能否利用檸檬酸的能力。有的細菌如產(chǎn)氣桿菌，能夠利用銨鹽作為唯一氮源，利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，則能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長。細菌分解利用檸檬酸鹽產(chǎn)生CO2,，CO2,與培養(yǎng)基中的Na+、H2O結合形成碳酸鈉，碳酸鈉與細菌利用銨鹽產(chǎn)生的氨反應，形成NH4OH，從而使培養(yǎng)基呈現(xiàn)堿性，使變色范圍為pH6.0(黃色)~pH7.6(藍色)的溴香草酚藍指示劑由綠色轉為深藍色，此為檸酸鹽反應陽性。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌如大腸桿菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。

6.硫化氫試驗

某些細菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產(chǎn)生硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成硫化鉛或硫化鐵黑色沉淀，為硫化氫試驗陽性，黑色沉淀物愈多，表示生成的疏化氫量亦愈多。硫化氫試驗培養(yǎng)基中含有硫代硫酸鈉，作為一種還原劑，能保持培養(yǎng)基中生成的硫化氫不再被氧化。

硫化氫試驗主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬的細菌，絕大多數(shù)呈硫化氫試驗陽性，其他菌屬多為陰性沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。如產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌硫化氫試驗陽性，大腸桿菌硫化氫試驗陰性。

7.明膠液化試驗

明膠是膠原水解產(chǎn)物，是生物來源的多肽，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體狀態(tài)存在，而在25℃以上時明膠就會液化。某些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶--明膠酶。明膠酶能分解明膠生成氨基酸，從而使明膠失去凝固力，半固體明膠培養(yǎng)基成為流動的液體培養(yǎng)基。有的甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。明膠液化試驗可用于腸桿菌科細菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等能液化明膠，多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。

8.淀粉水解試驗

細菌不能直接利用大分子的淀粉，須將淀粉水解為小分子物質后才可吸收利用。某些細菌可產(chǎn)生胞外淀粉酶，將淀粉水解后產(chǎn)生糊精或進一步水解為雙糖或單糖后使其運輸?shù)襟w內。細菌產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即加碘液測定時不再產(chǎn)生藍色。

9.硝酸鹽還原試驗

硝酸鹽還原(nitratereduetion)是生物體內的一種氧化還原反應，即硝酸鹽在硝酸還原酶的作用下，還原成亞硝酸的反應。一般指有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。格里斯試劑可用于特征性檢驗亞硝酸根:產(chǎn)生的亞硝酸鹽與Z酸反成生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氨基苯磺酸:生成的重氨基苯磺酸與α-萘胺結合生成N-α萘胺偶苯磺酸(紅色化合物)，表明細菌能還原硝酸鹽產(chǎn)生亞硝酸鹽，此為硝酸鹽還原試驗陽性。格里斯試劑A液為對氨基苯磺酸加乙酸，格里斯試劑B液為α-萘胺。

硝酸鹽還原試驗廣泛用于細菌鑒定，腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。硝酸鹽還原過程可因細菌不同而異。有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸桿菌等:有的細菌則可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨:有的細菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽還原試驗要排除干擾，由于亞硝酸鹽在自然界廣泛分布，容易污染試劑，因此只有對照管陰性時，才能根據(jù)試驗結果進行判斷。硝酸鹽的存在可用二苯胺試劑檢驗。在酸性條件下，二苯胺經(jīng)硝酸氧化后呈氧化態(tài)的顏色即深藍色或紫色(圖1)。

圖1

三、實驗器材與試劑

1.實驗儀器

恒溫培養(yǎng)箱、試管、無菌培養(yǎng)皿、杜氏小管、接種環(huán)、酒精燈。

2.微生物材料

大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌斜面

3.培養(yǎng)基

(1)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖發(fā)酵試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

(2)乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(乳糖發(fā)酵試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

(3)胰蛋白水培養(yǎng)基(吲哚試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

(4)葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基(甲基紅試驗和VP試驗):每組6支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基5~10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中2支試管分別作為甲基紅試驗和VF試驗的陰性對照，另外4支用于接種細菌，甲基紅試驗和VP試驗各2支。

(5)檸檬酸鈉固體培養(yǎng)基(檸檬酸鹽利用試驗):每組3支試管，5~10mL/管，培養(yǎng)基配制好分裝于試管后滅菌，滅菌完成擺成斜面?zhèn)溆?。試管上標明培養(yǎng)基名稱，其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

(6)檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基(硫化氫試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌

(7)明膠培養(yǎng)基(明膠液化試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL，試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

(8)淀粉固體培養(yǎng)基(淀粉水解試驗):每組60mL，滅菌后倒于3個平板，15~20mL/皿，平板上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1個平板試管作為陰性對照，另外2個平板用于接種細菌。

(9)硝酸鹽培養(yǎng)基(硝酸鹽還原試驗):每組3支試管，每支試管分裝培養(yǎng)基10mL試管上標明培養(yǎng)基名稱。滅菌后其中1支試管作為陰性對照，另外2支用于接種細菌。

4.實驗用具

試管、杜氏小管、接種針、接種環(huán)、酒精燈、火柴、試管架、記號筆。

5.實驗試劑

甲基紅試劑、VP試劑、吲哚試劑、格里斯試劑(A、B)、盧戈氏碘液。

四、實驗內容與方法

1.葡萄糖發(fā)酵試驗

(1)接種:取3支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，其中1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，留下1支不接種作為陰性對照管。試管上標明所接種的菌名和組號。

(2)培養(yǎng):將已接種好的試管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(3)結果觀察:

產(chǎn)酸產(chǎn)氣:細菌能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸，使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中指示劑呈酸性反應，呈現(xiàn)黃色:倒置的杜氏小管中產(chǎn)生氣體(氣體占杜氏小管的10%以上)。

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:細菌能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸但不產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，杜氏小管中無氣泡產(chǎn)生。

不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:若被測細菌不分解培養(yǎng)基中的葡萄糖，則培養(yǎng)基顏色仍為紫色，不發(fā)生變化，且杜氏小管中無氣泡產(chǎn)生。

2.乳糖發(fā)酵試驗

(1)接種:取3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，其中1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，留下1支不接種作為陰性對照管。試管上標明所接種的菌名和組號。

(2)培養(yǎng):將已接種好的試管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(3)結果觀察:

產(chǎn)酸產(chǎn)氣:細菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生有機酸，使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中指示劑呈酸性反應，呈現(xiàn)黃色;倒置的杜氏小管中產(chǎn)生氣體(氣體占杜氏小管的10%以上)

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:細菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生有機酸但不產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，杜氏小管中無氣泡產(chǎn)生。

不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣:若被測細菌不分解培養(yǎng)基中的乳糖，則培養(yǎng)基顏色仍為紫色，不發(fā)生變化，且杜氏小管中無氣泡產(chǎn)生。

3.吲哚試驗

(1)接種:取3支胰蛋白胨水培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種留作陰性對照。試管上標明所接種的菌名和組號。

(2)培養(yǎng):37 ℃培養(yǎng) 24~48h。

(3)結果觀察:沿試管壁緩慢滴加幾滴吲哚試劑，注意不要搖動試管，使試劑浮于培養(yǎng)液上層。兩液交界面處呈現(xiàn)玫瑰紅色為陽性，不變色為陰性。

4.甲基紅試驗

(1)接種:取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管。1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種留作陰性對照。試管上標注所接種的菌名和組號。

(2)培養(yǎng):37℃恒溫培養(yǎng)48h。

(3)觀察結果:加入甲基紅指示劑數(shù)滴。培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。

5.VP 試驗

(1)接種:取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種作為陰性對照。

(2)培養(yǎng):37℃培養(yǎng)48h取出。

(3)觀察結果:培養(yǎng)結束后，往試管培養(yǎng)液中加人5~10滴40%KOH，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩試管，再放人37℃培養(yǎng)箱中保溫15~30min 加快反應速度若培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，則為VP試驗陽性。

6.檸檬酸鹽利用試驗

(1)接種:取3支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌1支不接種作為陰性作對照。

(2)培養(yǎng):37 ℃培養(yǎng)24 h。

(3)觀察結果:與陰性對照比較，如果斜面上有細菌生長、培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钏{色為陽性結果;若培養(yǎng)基不變色，繼續(xù)培養(yǎng)5~7天，培養(yǎng)基仍不變色保持綠色則為陰性。

7.硫化氫試驗

(1)接種:取3支檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基試管，采用管壁穿刺接種法接種(即無菌接種針挑取菌種后沿著試管管壁穿刺接種)，1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，1支不接種作為陰性對照。

(2)培養(yǎng):接種好的試管培養(yǎng)物置于37℃培養(yǎng)24h。

(3)觀察結果:試管培養(yǎng)基中若出現(xiàn)黑色沉淀線為陽性。培養(yǎng)基顏色不變?yōu)殛幮浴?/p>

8.明膠液化試驗

(1)接種:取3支營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基試管，用穿刺接種法接種，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌，1支不接種作為陰性對照。

(2)培養(yǎng):37℃培養(yǎng)48h。

(3)觀察結果:觀察明膠的液化情況。若室溫較高，培養(yǎng)基自行熔化時，可將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4℃冰箱30min，然后取出觀察結果，不再凝固表明明膠已被細菌液化，此為明膠液化試驗陽性。

9.淀粉水解實驗

(1)接種:淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，無菌操作制成平板。平板冷卻后，取3個平板，用無菌接種環(huán)在1個平板上劃線接種(蛇形劃線)枯草桿菌，在另1個平板上劃線接種大腸桿菌(蛇形劃線)，另1個平板不接種作為陰性對照。

(2)培養(yǎng):接種后平板置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h。

(3)觀察結果:打開培養(yǎng)皿，將盧戈氏碘液逐滴滴加于平板上，輕輕搖動平皿，使碘液均勻布滿平板。如菌苔周圍有透明圈出現(xiàn)，表明細菌產(chǎn)生淀粉酶，淀粉已被水解。相對于菌落直徑，透明圈越大，說明該菌水解淀粉能力越強。

10.硝酸鹽還原試驗

(1)接種:取3支硝酸鹽培養(yǎng)基試管，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌，另1支不接種作為陰性對照。

(2)培養(yǎng)與觀察:37℃培養(yǎng)18~96h。用無菌吸管吸取培養(yǎng)物2mL加于試管內，加入格里斯試劑A液和B液各1滴，與未接種細菌的陰性對照管相比較，立即或10min內觀察結果。若出現(xiàn)粉紅色、玫瑰色、橙色或棕色，則表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原試驗。

陽性。加入格里斯試劑后未出現(xiàn)紅色反應的培養(yǎng)物，用二苯胺試劑檢驗硝酸鹽的存在。傾斜試管，沿管壁慢慢滴入二苯胺試劑1~2滴，如培養(yǎng)液呈現(xiàn)藍色，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在而未被還原，無亞硝酸鹽存在，此為硝酸鹽還原試驗陰性。若加人格里斯試劑后未出現(xiàn)紅色變化的培養(yǎng)物，用二苯胺試劑檢驗仍無顏色反應(無藍色出現(xiàn))，表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都被還原成其他物質，該菌具有硝酸鹽還原作用，按硝酸鹽還原陽性處理。由于繁殖迅速、硝酸鹽還原能力強的細菌，培養(yǎng)時間過久可能將亞硝酸鹽全部分解成為氨氣和氮氣，故須每天進行結果檢驗。

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