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什么是流式細(xì)胞術(shù)？

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）能夠快速測(cè)定細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，并可以對(duì)特定的細(xì)胞進(jìn)行分選收集。廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

高速客觀、結(jié)果穩(wěn)定、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能夠處理復(fù)雜樣本并同時(shí)獲取多種參數(shù)，是它的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。

那么，流式細(xì)胞儀究竟可檢測(cè)哪些樣本？都能檢測(cè)什么指標(biāo)？今天就具體來(lái)給大家講一講樣本的分類(lèi)以及流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用有哪些。

①可檢測(cè)樣本類(lèi)型

?外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、洗脫液、實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、微生物。

②可檢測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)

?如細(xì)胞大小、細(xì)胞粒度、DNA含量與細(xì)胞周期 （可以發(fā)現(xiàn)癌前病變，協(xié)助腫瘤早期診斷) 、RNA含量、蛋白質(zhì)含量、染色體分析（可用于人類(lèi)基團(tuán)組研究、遺傳病和癌癥的診聽(tīng)的研究）等。

③可檢測(cè)細(xì)胞功能

?如細(xì)胞表面/包漿/核的特異性抗原 (評(píng)估人體細(xì)院免疫功能，對(duì)血液病的診斷和治療檢測(cè))、細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、酶活性、激素結(jié)合位點(diǎn) 、細(xì)胞受體、細(xì)胞凋亡（研究多藥耐藥基因）等。

在了解了流式細(xì)胞術(shù)覆蓋的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型后，就要開(kāi)始進(jìn)行實(shí)際操作了，有3個(gè)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常常會(huì)踩「坑」需要提前注意，包括：

● 小心熒光淬滅：如果抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熒光是會(huì)逐漸淬滅的。那如果不得不推遲實(shí)驗(yàn)可以把試管放在冰里面，延長(zhǎng)淬滅的時(shí)間。

● 注意染色順序：做一系列的不同染色順序的樣本，通過(guò)對(duì)染色前和染色后的各種樣本進(jìn)行比較分析，判斷染色順序?qū)?xì)胞造成的影響。

● 選好染色方案：在正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)出一個(gè)完美的染色方案。（考慮試劑種類(lèi)，試劑質(zhì)量，試劑用量，孵育時(shí)間，洗滌次數(shù)，染料濃度，染色時(shí)間及染色溫度等其他因素）。

了解完流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)樣本，那么，流式細(xì)胞術(shù)具體應(yīng)用在哪些領(lǐng)域呢？我們也來(lái)了解下。

01

流式細(xì)胞術(shù)科研應(yīng)用

①細(xì)胞凋亡檢測(cè)

在正常細(xì)胞中，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）位于胞漿側(cè)。細(xì)胞凋亡中期，PS 外翻。Annexin V 是一種 Ca2+ 依賴的對(duì) PS 具有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，因此可以用熒光標(biāo)記的 Annexin V 檢測(cè) PS 的外翻。凋亡末期，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，原本不透膜的核酸染料（如 PI、7-AAD 等）也能進(jìn)入細(xì)胞，從而產(chǎn)生信號(hào)。分別檢測(cè) Annexin V 和不透膜核酸染料的信號(hào)，可對(duì)凋亡中期和末期細(xì)胞的比例進(jìn)行定量。

②細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞核 DNA 含量隨著細(xì)胞增殖周期時(shí)相的不同而發(fā)生變化，用 DNA 染料進(jìn)行染色，DNA 含量多，熒光信號(hào)強(qiáng)，DNA 含量少，熒光強(qiáng)度低。通過(guò)對(duì)細(xì)胞瞬間的快速測(cè)定，判斷細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相，并分析群體細(xì)胞中處于不同周期時(shí)相的細(xì)胞比例，以研究細(xì)胞的周期，DNA 復(fù)制和染色體倍性等。在腫瘤學(xué)研究中尤其常用，可以此來(lái)判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞影響、腫瘤的生長(zhǎng)速度與患者預(yù)后等。

③Th/Treg檢測(cè)

通過(guò)刺激阻斷劑對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行處理，通過(guò)檢測(cè)表面或胞內(nèi)標(biāo)志物進(jìn)行分型檢測(cè)。

④免疫分型檢測(cè)

利用細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)特異性抗體分子，分別選用不同標(biāo)記的流式抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分型和分析。

利用抗原/抗體反應(yīng)原理，采用不同的流式抗體對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)可達(dá)到對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行分型檢測(cè)的目的。

⑤細(xì)胞因子檢測(cè)

采用 CBA 或液相芯片的方法將捕獲抗體和微球/液相芯片結(jié)合，檢測(cè)抗體和 SA-PE 結(jié)合通過(guò)抗原抗體特異性反應(yīng)達(dá)到多種細(xì)胞因子檢測(cè)的目的。

⑥細(xì)胞分選

細(xì)胞分選利用流式細(xì)胞分選儀來(lái)分離純化細(xì)胞或顆粒以供進(jìn)一步分析。

⑦其他

其他還包括死/活細(xì)胞檢測(cè)、線粒體檢測(cè)、外泌體檢測(cè)。

02

流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用

①淋巴細(xì)胞亞群分析

淋巴細(xì)胞亞群分析可以了解機(jī)體在不同條件下的免疫功能狀態(tài)，主要包括細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。在臨床上，主要用于對(duì)免疫系統(tǒng)造成明顯干擾的相關(guān)疾病的輔助診斷，分析疾病的發(fā)病機(jī)理，監(jiān)控疾病的病程進(jìn)展，觀測(cè)療效及監(jiān)測(cè)預(yù)后等等。

主要檢測(cè)項(xiàng)目：淋巴細(xì)胞亞群（TBNK）、T 淋巴細(xì)胞分型、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）檢測(cè)等。

②HLA-B27 檢測(cè)

強(qiáng)直性脊椎炎患者其 HLA-B27 抗原表達(dá)為陽(yáng)性，為強(qiáng)制性脊柱炎的重要標(biāo)志物，因此 HLA-B27 的檢測(cè)在疾病的診斷中有著重要意義。

③白血病免疫分型

白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。國(guó)際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。FCM 分析白血病免疫表型具有快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。

主要檢測(cè)項(xiàng)目：急性白血病、慢性淋巴增生性疾?。–LD）/淋巴瘤等檢測(cè)

④造血干細(xì)胞分析

造血干細(xì)胞移植已被廣泛用于治療各種惡性血液疾病、遺傳性疾病、實(shí)體腫瘤、重癥聯(lián)合免疫缺陷病等。移植后造血功能的重建主要取決于輸入造血干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。臨床上快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)移植物中造血干細(xì)胞水平，能夠確保移植成功，在造血干細(xì)胞移植中有重要意義。CD34 分子為造血干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志物，可用于造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)。

⑤細(xì)胞因子檢測(cè)

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞（由單核、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）和某些非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白。通過(guò)對(duì)多個(gè)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析，可達(dá)到對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)進(jìn)行整體評(píng)估，進(jìn)而更好地為醫(yī)師提供有價(jià)值的輔助診斷信息，為患腫瘤、免疫性疾病以及感染性疾病的患者制定更加有效的治療方案。

⑥其他

細(xì)胞分選利用流式細(xì)胞分選儀來(lái)分離純化細(xì)胞或顆粒以供進(jìn)一步分析。其他還包括：陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）診斷 （CD55/CD59 檢測(cè)）、血小板相關(guān)分析（血小板計(jì)數(shù)、血小板免疫表型分析）、感染性疾病診斷（CD64 檢測(cè)）、程序性死亡受體-1（PD-1/CD279）檢測(cè)等。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

END

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