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小編整理了 5 個(gè) WB 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)技巧，帶你從細(xì)節(jié)手法出發(fā)，優(yōu)化 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5個(gè) WB 細(xì)節(jié)，帶你靠自己的雙手，拿到漂亮圖！

樣本切記煮沸勿偷懶

煮沸的首要目的是使蛋白質(zhì)完全變性，即破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，使其展開(kāi)成線性形式。

這樣，蛋白質(zhì)分子在電泳過(guò)程中的遷移速率將主要取決于它們的分子量，而不是它們的構(gòu)型差異。

將樣本與加載緩沖液按 1:1 比例混合將混合后的樣本在沸水浴中煮沸 5 分鐘，這個(gè)步驟可以確保蛋白質(zhì)的變性。

煮沸過(guò)程中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成更加均勻，有助于蛋白質(zhì)在凝膠中的一致性遷移。

煮沸后立即將樣品置于冰上冷卻，這一步是為了終止變性過(guò)程，防止蛋白質(zhì)在高溫下過(guò)度降解或重新聚集。

加載緩沖液的成分：0.5M Tris-HCl pH 6.8

作用：提供一個(gè)穩(wěn)定的 pH 環(huán)境，有助于蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中保持穩(wěn)定。

加載緩沖液的成分：2% SDS

作用：SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)合物，使其帶負(fù)電荷。

加載緩沖液的成分：10% 甘油

作用：增加樣品的黏度，有助于樣品在凝膠孔中的均勻分布。

加載緩沖液的成分：0.01% 溴酚藍(lán)

作用：作為追蹤染料，幫助觀察樣品在電泳過(guò)程中的遷移情況。

加載緩沖液的成分：5% β 巰基乙醇

作用：有助于破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的變性。

通過(guò)這些步驟，可以確保蛋白質(zhì)在凝膠電泳中的表現(xiàn)更加一致和準(zhǔn)確，從而得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

電泳條件需謹(jǐn)慎遵循

電泳條件對(duì)于 Western Blot 實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懙鞍踪|(zhì)的分離效率和結(jié)果的清晰度，但是很多同學(xué)會(huì)「湊合用膠」，沒(méi)有完全根據(jù)目標(biāo)蛋白大小選擇合適的凝膠濃度和電泳條件。

不過(guò)也要注意，電壓推薦是針對(duì)恒定電壓條件下的電泳，實(shí)際使用時(shí)應(yīng)根據(jù)凝膠的尺寸、電泳槽的類(lèi)型以及具體的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。

另外對(duì)于較小分子量的蛋白質(zhì)，可能需要使用較高的電壓以加快遷移速度，但要注意避免過(guò)熱和條帶壓縮。

對(duì)于較大的蛋白質(zhì)，使用較低的電壓有助于減少條帶壓縮，但可能需要更長(zhǎng)的電泳時(shí)間來(lái)確保充分分離。

最后，實(shí)驗(yàn)中可能需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整電壓和凝膠濃度，以獲得最佳的分離效果。

ECL 底物添加有技巧

提供足夠的底物以產(chǎn)生穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。不過(guò)一定要嚴(yán)格按照制造商提供的說(shuō)明書(shū)來(lái)配制 ECL 底物。很多同學(xué)在這步容易使用已經(jīng)配置、使用過(guò)的 ECL 底物，可能會(huì)影響研究結(jié)果。操作步驟：

配制 ECL 底物

目的和注意事項(xiàng)：按照說(shuō)明書(shū)比例混合 A 和 B 組分，確保新鮮配制

膜的預(yù)處理

目的和注意事項(xiàng)：確保膜完全濕潤(rùn)，無(wú)氣泡，使用適當(dāng)?shù)木彌_液

浸泡膜于 ECL 底物中

目的和注意事項(xiàng)：1 分鐘，確保膜表面均勻覆蓋，避免過(guò)長(zhǎng)浸泡導(dǎo)致底物干燥或過(guò)度滲透

去除膜表面多余底物

目的和注意事項(xiàng)：輕輕搖動(dòng)或用濾紙吸去，減少背景噪音

封閉袋內(nèi)成像

目的和注意事項(xiàng)：根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間，進(jìn)行成像初始曝光時(shí)間可以從短曝光開(kāi)始（例如 5 秒或 30 秒），根據(jù)成像結(jié)果調(diào)整，一般會(huì)選擇過(guò)曝前的 3-5 張結(jié)果來(lái)進(jìn)行分析、使用。

使用手套做實(shí)驗(yàn)！千萬(wàn)別觸碰

使用一次性手套在實(shí)驗(yàn)室中是基本的無(wú)菌操作要求，尤其在細(xì)胞間，但是出了細(xì)胞間，很多同學(xué)就開(kāi)始用「回收手套」，甚至不戴手套拿個(gè)管子瓶子，這也會(huì)對(duì) WB 實(shí)驗(yàn)帶來(lái)交叉污染。

可能影響：交叉污染

具體說(shuō)明：皮膚油脂、死皮細(xì)胞或微生物可能污染樣本，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。預(yù)防措施：在處理樣本前后更換一次性手套，避免接觸不同樣本時(shí)的交叉污染。

可能影響：樣品降解

具體說(shuō)明：皮膚上的酶可能降解樣本中的蛋白質(zhì)，影響目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。預(yù)防措施：使用手套防止皮膚直接接觸樣本。

可能影響：膜損壞

具體說(shuō)明：直接接觸可能導(dǎo)致 PVDF 或硝酸纖維素膜的物理?yè)p傷。預(yù)防措施：佩戴手套以減少直接接觸，使用鑷子或?qū)Ｓ霉ぞ卟僮鳌?/p>

可能影響：試劑污染

具體說(shuō)明：手套可以防止皮膚油脂污染試劑，保持試劑的純凈度。預(yù)防措施：始終佩戴手套處理試劑。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了佩戴手套外，還應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容采取其他個(gè)人防護(hù)措施，如實(shí)驗(yàn)室大衣、護(hù)目鏡等。

通過(guò)遵循這些操作指南和注意事項(xiàng)，可以最大限度地減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的交叉污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

注意儀器的日常維護(hù)

最后的最后，別忘記提醒實(shí)驗(yàn)室研究員定期校準(zhǔn)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，檢查電壓和電流的穩(wěn)定性。

清潔和維護(hù)設(shè)備，確保無(wú)漏電或短路；校準(zhǔn)應(yīng)記錄電壓、電流和時(shí)間，確保設(shè)備在規(guī)定范圍內(nèi)運(yùn)行。

日常維護(hù)：每次使用儀器后進(jìn)行，主要是清潔工作，確保儀器表面和操作區(qū)域的清潔。

月度檢查：每月進(jìn)行，重點(diǎn)在于檢查儀器的所有控制元件和指示系統(tǒng)是否正常工作。

季度檢查：每 3 個(gè)月進(jìn)行一次，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀分別進(jìn)行性能校準(zhǔn)和溫度系統(tǒng)檢查，以確保設(shè)備性能穩(wěn)定。

半年檢查：每 6 個(gè)月進(jìn)行深度清潔和安全檢查，包括清潔難以觸及的部分和檢查電線、連接器等，以確保設(shè)備安全。

通過(guò)精確控制這些關(guān)鍵細(xì)節(jié)，相信大家也可以顯著提高 WB 實(shí)驗(yàn)的成功率和結(jié)果的可靠性。拒絕科研造假，用自己的雙手做出漂亮條帶！

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主營(yíng)項(xiàng)目

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

END

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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