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一、細(xì)胞

    
1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度.
貼壁細(xì)胞:考慮到細(xì)胞大小不同，建議根據(jù)具體情況適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞的密度布局。
懸浮細(xì)胞:一般在96孔板中，每個(gè)孔放置10000個(gè)細(xì)胞，可通過細(xì)胞計(jì)數(shù)的方式來進(jìn)行布板。

    采用狀態(tài)很好的細(xì)胞去鋪版,傳代太多的細(xì)胞不宜拿來使用。鋪版如果太稀細(xì)胞的殺傷不會(huì)很明顯,太密細(xì)胞可能都會(huì)死掉,細(xì)胞密度多采用10000個(gè)/孔.100ul/孔

2.藥物濃度和處理時(shí)間的設(shè)定.
    不同類型的細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性存在差異。若藥物濃度未知，可查閱文獻(xiàn)，參考他人的研究結(jié)果來初步確定一個(gè)較大的范圍，計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），并根據(jù)IC50值來設(shè)定藥物的使用濃度。

3.培養(yǎng)時(shí)間.
如果要培養(yǎng)48h以上,就換液。(48h換液)

4.無菌操作
在進(jìn)行MTT或CCK8實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)務(wù)必進(jìn)行無菌操作，因?yàn)橐坏┪廴緯?huì)嚴(yán)重影響吸光值的準(zhǔn)確性。細(xì)菌污染也會(huì)導(dǎo)致比色反應(yīng)的光密度值升高，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來干擾。

5.設(shè)置對(duì)照
   在實(shí)驗(yàn)過程中，需要設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔和加藥孔。調(diào)零孔中應(yīng)加入培養(yǎng)基、MTT或CCK-8以及DMSO；對(duì)照孔和加藥孔均需加入細(xì)胞、培養(yǎng)液和MTT或CCK-8。對(duì)照孔中需加入溶解藥物的介質(zhì)，通常為DMSO，而加藥組則需要添加不同濃度的藥物。

6.設(shè)置副孔
每個(gè)處理組至少設(shè)置3個(gè)副孔,3-5個(gè)都可以.

二、實(shí)驗(yàn)步驟

    
（1）需要做的操作包括收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度在1萬至2萬個(gè)細(xì)胞/毫升之間，取100微升加入96孔板中。同時(shí)，對(duì)于96孔板的處理，需要在邊緣孔中使用無菌PBS或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基進(jìn)行填充。在每個(gè)孔中，準(zhǔn)備3至5個(gè)副孔。

（2）懸浮細(xì)胞鋪好板放37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時(shí),之后即可加藥。藥物建議現(xiàn)配現(xiàn)用,采用半比稀釋法,培養(yǎng)基配藥。(長(zhǎng)期保存的藥物實(shí)用說明書規(guī)定的溶液配,例如DMSO,一次性使用的采用培養(yǎng)基稀釋藥物,達(dá)到最終使?jié)舛取?

（3）置37℃,5%CO2孵育到藥物處理時(shí)間。

（4）在每個(gè)孔中加入10μL MTT 溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。也可以考慮使用CCK-8 替代 MTT，更加方便。

（5）經(jīng)過4小時(shí)處理后，每個(gè)孔加入100ul MTT緩沖液，反應(yīng)至指定時(shí)間，以確保結(jié)晶物充分溶解。隨后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在OD 570nm（經(jīng)過630nm校準(zhǔn)）下測(cè)量各孔的吸光值。

三、MMT的配制

    
    我通常建議現(xiàn)配現(xiàn)用MTT，并在過濾后于4℃避光保存。配制好的MTT需要保持無菌，因?yàn)镸TT對(duì)細(xì)菌非常敏感。添加到96孔板時(shí)可以不避光，或者將操作臺(tái)上的照明燈關(guān)閉。在配制MTT時(shí)，我們建議使用PBS溶解，并在60℃水浴中輔以超聲處理以幫助溶解。

四、加入MMT

    
  MTT的添加量寧多勿少，10 μl足矣。若某些孔在加入MTT后立即呈現(xiàn)藍(lán)黑色，則說明可能受到污染。在加入MTT之前，建議先在顯微鏡下觀察，查看是否存在孔內(nèi)的細(xì)胞受到了細(xì)菌污染。

CKK8使用方法
1、將100ul細(xì)胞懸液接種至96孔板中，并置于預(yù)熱至37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
2、向每個(gè)孔中添加10ul的CCK-8試劑。
3、將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-4小時(shí)。
4、在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，參考波長(zhǎng)設(shè)定為600nm以上。

OD值的測(cè)定
    細(xì)胞密度較高時(shí)測(cè)得的吸光度也會(huì)偏高，而細(xì)胞密度較低時(shí)吸光度則會(huì)偏低。此外，吸光度值也與細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)，細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)吸光度值通常較低。細(xì)胞數(shù)量較少或培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)，OD值也會(huì)偏低。若各孔之間的差異性明顯，可能存在污染現(xiàn)象，如空白孔的OD值異常高，則很可能是受到細(xì)菌污染的影響。

    為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，通常會(huì)為每個(gè)濃度設(shè)置5-6個(gè)復(fù)制孔。在最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)，可以排除一個(gè)最高值和一個(gè)最低值，或者剔除那些可能出現(xiàn)的異常數(shù)值。這些異常數(shù)值的出現(xiàn)可能與多種因素有關(guān)，如細(xì)胞污染情況、細(xì)胞死亡情況、培養(yǎng)液蒸發(fā)程度、MTT液的準(zhǔn)確使用，以及在37℃和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育時(shí)間是否恰當(dāng)（通常為1-4小時(shí)）。這些因素之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。

五、注意事項(xiàng)

    
1.建議控制細(xì)胞的接種密度，尤其對(duì)于懸浮細(xì)胞。一般來說，每孔10000個(gè)左右的細(xì)胞數(shù)量是合適的，不要過多。特別是對(duì)于腫瘤細(xì)胞，更要注意避免過高的接種密度，寧少勿多。這樣可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2."對(duì)于MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)來說，它們本身就是相對(duì)粗略的實(shí)驗(yàn)方法，因此在結(jié)果中出現(xiàn)小幅波動(dòng)或誤差屬于正?，F(xiàn)象。"

3.在進(jìn)行鋪板時(shí)，務(wù)必確保細(xì)胞懸液充分混合，并且如果長(zhǎng)時(shí)間靜置，需要用槍頭重復(fù)吹打幾次來達(dá)到混合均勻的效果。如果細(xì)胞分布不均勻，會(huì)導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不一致，建議每接幾個(gè)孔就進(jìn)行混勻操作。移液槍的操作需要熟練，盡量避免不必要的誤差。另外，過多的吹散次數(shù)也會(huì)影響細(xì)胞的活力，因此請(qǐng)盡快完成鋪板操作。

4. 在進(jìn)行吹打操作時(shí)，需要注意細(xì)胞懸液的總量不宜過多。過多的懸液不僅容易造成污染，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)不易被吹散。建議將細(xì)胞懸液控制在6-7ml左右為宜。若懸液量過少，容易產(chǎn)生大量氣泡，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

5.吸液時(shí)應(yīng)將吸頭放置于懸浮液底部，稍微提起一點(diǎn)，而在吹液入管時(shí)則要保持接近液面，以避免產(chǎn)生氣泡。

6.每塊板加完后記得晃動(dòng)培養(yǎng)板,使得細(xì)胞能分散的均勻些,鋪好板之后精置2min,靜下觀察細(xì)胞分布均勻度以及每孔細(xì)胞量是否大概一致。

7.免邊緣效應(yīng)指的是在96孔板中，四周一圈的孔通常只用作空白對(duì)照，不應(yīng)該培養(yǎng)細(xì)胞，否則這四排數(shù)據(jù)可能會(huì)出現(xiàn)偏高或偏低的情況。在最外側(cè)一圈的孔中，務(wù)必添加水、PBS或培養(yǎng)液，只要能夠有效防止蒸發(fā)即可。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

END

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