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1.蛋白質(zhì)疏水相互作用產(chǎn)生的背景

在水性介質(zhì)中，當(dāng)大分子的表面張力低于水的表面張力時(shí)，就會(huì)發(fā)生疏水相互作用。疏水力是成功結(jié)合Ag-Ab的關(guān)鍵，但它們也會(huì)產(chǎn)生不可接受的背景。由于相鄰組織蛋白內(nèi)部和之間反應(yīng)性ε和α-氨基酸的交聯(lián)，通過與含醛固定劑固定，組織蛋白變得更疏水。

固定過程中蛋白質(zhì)疏水性的增加增加了免疫組織化學(xué)程序中的背景染色;因此，應(yīng)避免長時(shí)間固定在福爾馬林或其他醛類固定劑中。這種過度固定引起的背景染色可以通過使用Bouin固定劑、Zenker固定劑或B5固定劑進(jìn)行后固定來補(bǔ)救。

Ig也是疏水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)，尤其是IgG的Abs1和IgG3子導(dǎo)致疏水性增加的聚集和聚合是Igs儲(chǔ)存過程中觀察到的另一個(gè)問題。組織切片中偶聯(lián)物和極性基團(tuán)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用也會(huì)產(chǎn)生背景。Igs疏水性增加的另一個(gè)原因是Abs的生物素化，它可以改變它們的pI。

有幾種方法可以減少Ig和組織蛋白的疏水結(jié)合，包括pH值與抗體pI不同的稀釋緩沖液（特別是對(duì)于單克隆抗體）;離子強(qiáng)度低（鹽濃度低）的稀釋劑;在稀釋劑中加入非離子洗滌劑（例如吐溫20、TritonX）或乙二醇;或提高用于多克隆抗體的稀釋劑的pH值。

減少疏水相互作用背景的最常見方法，在原代抗體孵育之前使用封閉蛋白：用正常血清阻斷非特異性背景。在一抗（左）之前添加的正常血清將阻斷一抗血清的非特異性結(jié)合。當(dāng)不使用封閉（右）時(shí)，一抗可以結(jié)合產(chǎn)生背景的組織切片中的不相關(guān)抗原（藍(lán)色子彈是一抗靶向的抗原）。

通常，它與同一物種的Igs一起進(jìn)行到次級(jí)鏈接或標(biāo)記Ab;然而，可以使用牛血清白蛋白、魚明膠、胎牛血清、脫脂奶粉，以及最近的酪蛋白。酪蛋白似乎比正常血清更有效地阻斷疏水性背景染色。

2.離子和靜電相互作用產(chǎn)生的背景

離子相互作用是控制Ag-Ab相互作用的主要力量之一，但它們也有助于非特異性背景。大多數(shù)Abs的pI范圍為5.8至8.5。11在稀釋緩沖液中常用的pH值下，Abs可以具有凈負(fù)電荷或正表面電荷，如果后者具有相反的凈表面電荷，則可以預(yù)期Igs和組織蛋白之間的離子相互作用。

Igs與帶負(fù)電荷的組織或細(xì)胞（例如內(nèi)皮、膠原蛋白）的非免疫結(jié)合可以通過具有高離子強(qiáng)度的稀釋緩沖液有效阻斷。含有1%硫酸鋅、0.01M檸檬酸鹽（pH6.0）或0.01MTris（pH9.0）的AR可導(dǎo)致非特異性核染色。

如果固定液的離子強(qiáng)度增加，則某些Ags的檢測(cè)會(huì)得到改善。解決免疫組織化學(xué)中的非特異性背景染色變得更加復(fù)雜，因?yàn)橐庾R(shí)到很多時(shí)候，這種非特異性染色是離子和疏水相互作用相結(jié)合的結(jié)果，并且如前所述，一種相互作用的補(bǔ)救措施會(huì)加重另一種。

3. 內(nèi)源性過氧化物酶活性

天然存在于紅細(xì)胞（假過氧化物酶）、粒細(xì)胞（髓過氧化物酶）和神經(jīng)元中的酶活性可與DAB反應(yīng)，產(chǎn)生與特異性免疫染色無法區(qū)分的棕色產(chǎn)物。盡管在福爾馬林固定過程中內(nèi)源性過氧化物酶活性幾乎完全被破壞，但用稀釋的（0.003-3%）H?O?對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理在甲醇中將進(jìn)一步降低或完全消除紅細(xì)胞的假過氧化物酶活性和髓系細(xì)胞中的過氧化物酶活性。

在大量出血或酸性血紅素的組織切片中，更強(qiáng)（10%）H?O?的溶液可能需要去除這種內(nèi)源性活動(dòng)，或在濃度較低的溶液中孵育更長時(shí)間。H?O?用途–不建議將甲醇用于檢測(cè)細(xì)胞表面Ags的標(biāo)本;此外，使用甲醇可能會(huì)將冷凍切片從載玻片上分離出來。在這些情況下，內(nèi)源性過氧化物酶活性可以被（0.3%）H?O?的混合物抑制在0.1%疊氮化鈉溶液中或H?O?用蒸餾水稀釋。使用非常靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，內(nèi)源性過氧化物酶背景可能更明顯。為了減少這種背景，H?O?需要增加濃度或使用替代酶。其他對(duì)Ag檢測(cè)有不同影響的方法也抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。

4. 內(nèi)源性堿性磷酸酶

AP作為報(bào)告分子的使用正在增加，因?yàn)樗龠M(jìn)了雙重免疫標(biāo)記并避免了造血組織中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)內(nèi)源性過氧化物酶活性問題。哺乳動(dòng)物組織中AP的兩種同工酶可以用AP方法產(chǎn)生背景染色：腸道和非腸道形式。非腸道形式很容易被1mM左旋咪唑（l-四咪唑）抑制，而來自小牛腸的同工酶（在免疫堿性方法中用作報(bào)告分子）不受影響。腸道亞型可以用1%的乙酸阻斷，但它會(huì)破壞一些Ags。內(nèi)源性堿性磷酸酶在常規(guī)福爾馬林固定和加工過程中也會(huì)被破壞。已經(jīng)報(bào)道了抑制內(nèi)源性AP的其他方法。

5. 親和素和生物素

堿性蛋清親和素對(duì)帶相反電荷的細(xì)胞分子（如核酸、磷脂和肥大細(xì)胞質(zhì)中的糖胺聚糖）的高離子吸引力可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合。蛋清親和素在pH值為10.0時(shí)具有pI，并且在免疫染色中使用的幾乎中性的pH值下具有堿性正電荷。這種非免疫結(jié)合可以通過制備pH值為9.4而不是7.6的ABC或LAB溶液或添加5%的脫脂奶粉溶液來防止。用鏈霉親和素（來自親和鏈霉菌）取代蛋清中的親和素，其pI值為5.5-6.5，可顯著降低IHC方法中的非特異性結(jié)合。

內(nèi)源性生物素廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中，特別是在肝、肺、脾、脂肪組織、乳腺、腎臟和大腦中。福爾馬林固定后，內(nèi)源性生物素的背景大大減弱，但在冷凍切片中可以明顯。一些腫瘤細(xì)胞可能具有含有生物素的核內(nèi)包涵體;妊娠期和產(chǎn)后的子宮內(nèi)膜細(xì)胞也可能含有核內(nèi)生物素包涵體。

檢測(cè)系統(tǒng)中使用的親和素與內(nèi)源性生物素的結(jié)合會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景，需要加以抑制。這種結(jié)合可以通過堿性緩沖液、用未標(biāo)記的親和素和生物素預(yù)孵育組織切片來抑制，或用脫脂奶粉孵育。

一些含有0.1%鏈霉親和素和0.01%生物素的商業(yè)試劑盒可阻斷這種內(nèi)源性活性。這可能會(huì)干擾核抗原染色（增殖標(biāo)志物、皰疹感染）的解釋。

內(nèi)源性親和素-生物素活性 （EABA）。在這種情況下，親和素-生物素-過氧酶復(fù)合物將非特異性結(jié)合組織，產(chǎn)生強(qiáng)背景。

阻止 EABA。在免疫反應(yīng)前添加未標(biāo)記的親和素和生物素將通過EABA阻斷非特異性背景。

6. 游離醛

假陽性染色可能是由于偶聯(lián)抗體與組織中存在的含醛固定劑引入的游離醛基團(tuán)的非特異性結(jié)合所致。這個(gè)問題在使用戊二醛時(shí)更為常見，但長時(shí)間固定在甲醛中也會(huì)產(chǎn)生游離醛。不同的化合物（硼氫化鈉、氯化銨、碳酸銨緩沖液、賴氨酸、甘氨酸）消除這種結(jié)合。

7. Fc受體

單核血細(xì)胞的Fc受體可以與抗血清的IgG結(jié)合，但這對(duì)于常規(guī)固定的石蠟包埋組織來說通常不是問題，因?yàn)镕c受體在此過程中被破壞。然而，當(dāng)淋巴組織的輕度固定、冷凍切片或含有Fc受體細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)制劑時(shí)，可能會(huì)發(fā)生原抗血清對(duì)組織的非特異性粘附。

由于Igs的Fc部分被膠原纖維中存在的堿性基團(tuán)吸引，石蠟切片也可能發(fā)生非特異性染色。F（ab′）的用途2Igs的片段而不是整個(gè)Ig分子消除了Fc受體或Igs的Fc部分的非特異性背景。

8. 非特異性抗原擴(kuò)散

可溶性蛋白從其組成細(xì)胞中擴(kuò)散并被其他不同譜系的細(xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)非特異性隔離是甲狀腺球蛋白檢測(cè)中的常見問題;它也可以與肌紅蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和其他細(xì)胞蛋白一起觀察到。

舉例：抗原擴(kuò)散背景;甲狀腺癌。該切片中結(jié)締組織和間質(zhì)被甲狀腺球蛋白抗體染色的強(qiáng)烈染色是甲狀腺球蛋白因固定不充分而擴(kuò)散的結(jié)果。

9. 顏料

含有豐富黑色素或黑色色素的組織，如含鐵血黃素，可降低免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的信噪比。如果色素與所檢查的 Ag 存在于同一細(xì)胞中，則可能無法解釋。或者，可以使用產(chǎn)生不同顏色沉淀物的檢測(cè)系統(tǒng)。另一種可能性是使用高錳酸鉀來阻斷黑色素，但這會(huì)損害某些表位。這種治療的替代方法是在免疫反應(yīng)完成后使用吉姆薩染色或 Azure B 染料作為復(fù)染劑;黑色素會(huì)染成綠色或藍(lán)綠色，DAB產(chǎn)品將保持棕色。

對(duì)于含鐵血黃素，在pH 5.0乙酸鹽緩沖液中加入1%的連二亞硫酸鹽溶液5分鐘可完全消除含鐵血黃素并降低背景。

 主 營 項(xiàng) 目 

1

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

END

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