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1.蛋白質(zhì)疏水相互作用產(chǎn)生的背景

在水性介質(zhì)中，當大分子的表面張力低于水的表面張力時，就會發(fā)生疏水相互作用。疏水力是成功結(jié)合Ag-Ab的關(guān)鍵，但它們也會產(chǎn)生不可接受的背景。由于相鄰組織蛋白內(nèi)部和之間反應性ε和α-氨基酸的交聯(lián)，通過與含醛固定劑固定，組織蛋白變得更疏水。

固定過程中蛋白質(zhì)疏水性的增加增加了免疫組織化學程序中的背景染色;因此，應避免長時間固定在福爾馬林或其他醛類固定劑中。這種過度固定引起的背景染色可以通過使用Bouin固定劑、Zenker固定劑或B5固定劑進行后固定來補救。

Ig也是疏水性很強的蛋白質(zhì)，尤其是IgG的Abs1和IgG3子導致疏水性增加的聚集和聚合是Igs儲存過程中觀察到的另一個問題。組織切片中偶聯(lián)物和極性基團之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用也會產(chǎn)生背景。Igs疏水性增加的另一個原因是Abs的生物素化，它可以改變它們的pI。

有幾種方法可以減少Ig和組織蛋白的疏水結(jié)合，包括pH值與抗體pI不同的稀釋緩沖液（特別是對于單克隆抗體）;離子強度低（鹽濃度低）的稀釋劑;在稀釋劑中加入非離子洗滌劑（例如吐溫20、TritonX）或乙二醇;或提高用于多克隆抗體的稀釋劑的pH值。

減少疏水相互作用背景的最常見方法，在原代抗體孵育之前使用封閉蛋白：用正常血清阻斷非特異性背景。在一抗（左）之前添加的正常血清將阻斷一抗血清的非特異性結(jié)合。當不使用封閉（右）時，一抗可以結(jié)合產(chǎn)生背景的組織切片中的不相關(guān)抗原（藍色子彈是一抗靶向的抗原）。

通常，它與同一物種的Igs一起進行到次級鏈接或標記Ab;然而，可以使用牛血清白蛋白、魚明膠、胎牛血清、脫脂奶粉，以及最近的酪蛋白。酪蛋白似乎比正常血清更有效地阻斷疏水性背景染色。

2.離子和靜電相互作用產(chǎn)生的背景

離子相互作用是控制Ag-Ab相互作用的主要力量之一，但它們也有助于非特異性背景。大多數(shù)Abs的pI范圍為5.8至8.5。11在稀釋緩沖液中常用的pH值下，Abs可以具有凈負電荷或正表面電荷，如果后者具有相反的凈表面電荷，則可以預期Igs和組織蛋白之間的離子相互作用。

Igs與帶負電荷的組織或細胞（例如內(nèi)皮、膠原蛋白）的非免疫結(jié)合可以通過具有高離子強度的稀釋緩沖液有效阻斷。含有1%硫酸鋅、0.01M檸檬酸鹽（pH6.0）或0.01MTris（pH9.0）的AR可導致非特異性核染色。

如果固定液的離子強度增加，則某些Ags的檢測會得到改善。解決免疫組織化學中的非特異性背景染色變得更加復雜，因為意識到很多時候，這種非特異性染色是離子和疏水相互作用相結(jié)合的結(jié)果，并且如前所述，一種相互作用的補救措施會加重另一種。

3. 內(nèi)源性過氧化物酶活性

天然存在于紅細胞（假過氧化物酶）、粒細胞（髓過氧化物酶）和神經(jīng)元中的酶活性可與DAB反應，產(chǎn)生與特異性免疫染色無法區(qū)分的棕色產(chǎn)物。盡管在福爾馬林固定過程中內(nèi)源性過氧化物酶活性幾乎完全被破壞，但用稀釋的（0.003-3%）H?O?對組織切片進行預處理在甲醇中將進一步降低或完全消除紅細胞的假過氧化物酶活性和髓系細胞中的過氧化物酶活性。

在大量出血或酸性血紅素的組織切片中，更強（10%）H?O?的溶液可能需要去除這種內(nèi)源性活動，或在濃度較低的溶液中孵育更長時間。H?O?用途–不建議將甲醇用于檢測細胞表面Ags的標本;此外，使用甲醇可能會將冷凍切片從載玻片上分離出來。在這些情況下，內(nèi)源性過氧化物酶活性可以被（0.3%）H?O?的混合物抑制在0.1%疊氮化鈉溶液中或H?O?用蒸餾水稀釋。使用非常靈敏的檢測系統(tǒng)時，內(nèi)源性過氧化物酶背景可能更明顯。為了減少這種背景，H?O?需要增加濃度或使用替代酶。其他對Ag檢測有不同影響的方法也抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。

4. 內(nèi)源性堿性磷酸酶

AP作為報告分子的使用正在增加，因為它促進了雙重免疫標記并避免了造血組織中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)內(nèi)源性過氧化物酶活性問題。哺乳動物組織中AP的兩種同工酶可以用AP方法產(chǎn)生背景染色：腸道和非腸道形式。非腸道形式很容易被1mM左旋咪唑（l-四咪唑）抑制，而來自小牛腸的同工酶（在免疫堿性方法中用作報告分子）不受影響。腸道亞型可以用1%的乙酸阻斷，但它會破壞一些Ags。內(nèi)源性堿性磷酸酶在常規(guī)福爾馬林固定和加工過程中也會被破壞。已經(jīng)報道了抑制內(nèi)源性AP的其他方法。

5. 親和素和生物素

堿性蛋清親和素對帶相反電荷的細胞分子（如核酸、磷脂和肥大細胞質(zhì)中的糖胺聚糖）的高離子吸引力可能導致非特異性結(jié)合。蛋清親和素在pH值為10.0時具有pI，并且在免疫染色中使用的幾乎中性的pH值下具有堿性正電荷。這種非免疫結(jié)合可以通過制備pH值為9.4而不是7.6的ABC或LAB溶液或添加5%的脫脂奶粉溶液來防止。用鏈霉親和素（來自親和鏈霉菌）取代蛋清中的親和素，其pI值為5.5-6.5，可顯著降低IHC方法中的非特異性結(jié)合。

內(nèi)源性生物素廣泛分布于哺乳動物組織中，特別是在肝、肺、脾、脂肪組織、乳腺、腎臟和大腦中。福爾馬林固定后，內(nèi)源性生物素的背景大大減弱，但在冷凍切片中可以明顯。一些腫瘤細胞可能具有含有生物素的核內(nèi)包涵體;妊娠期和產(chǎn)后的子宮內(nèi)膜細胞也可能含有核內(nèi)生物素包涵體。

檢測系統(tǒng)中使用的親和素與內(nèi)源性生物素的結(jié)合會產(chǎn)生很強的背景，需要加以抑制。這種結(jié)合可以通過堿性緩沖液、用未標記的親和素和生物素預孵育組織切片來抑制，或用脫脂奶粉孵育。

一些含有0.1%鏈霉親和素和0.01%生物素的商業(yè)試劑盒可阻斷這種內(nèi)源性活性。這可能會干擾核抗原染色（增殖標志物、皰疹感染）的解釋。

內(nèi)源性親和素-生物素活性 （EABA）。在這種情況下，親和素-生物素-過氧酶復合物將非特異性結(jié)合組織，產(chǎn)生強背景。

阻止 EABA。在免疫反應前添加未標記的親和素和生物素將通過EABA阻斷非特異性背景。

6. 游離醛

假陽性染色可能是由于偶聯(lián)抗體與組織中存在的含醛固定劑引入的游離醛基團的非特異性結(jié)合所致。這個問題在使用戊二醛時更為常見，但長時間固定在甲醛中也會產(chǎn)生游離醛。不同的化合物（硼氫化鈉、氯化銨、碳酸銨緩沖液、賴氨酸、甘氨酸）消除這種結(jié)合。

7. Fc受體

單核血細胞的Fc受體可以與抗血清的IgG結(jié)合，但這對于常規(guī)固定的石蠟包埋組織來說通常不是問題，因為Fc受體在此過程中被破壞。然而，當淋巴組織的輕度固定、冷凍切片或含有Fc受體細胞的細胞學制劑時，可能會發(fā)生原抗血清對組織的非特異性粘附。

由于Igs的Fc部分被膠原纖維中存在的堿性基團吸引，石蠟切片也可能發(fā)生非特異性染色。F（ab′）的用途2Igs的片段而不是整個Ig分子消除了Fc受體或Igs的Fc部分的非特異性背景。

8. 非特異性抗原擴散

可溶性蛋白從其組成細胞中擴散并被其他不同譜系的細胞或細胞間質(zhì)非特異性隔離是甲狀腺球蛋白檢測中的常見問題;它也可以與肌紅蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白和其他細胞蛋白一起觀察到。

舉例：抗原擴散背景;甲狀腺癌。該切片中結(jié)締組織和間質(zhì)被甲狀腺球蛋白抗體染色的強烈染色是甲狀腺球蛋白因固定不充分而擴散的結(jié)果。

9. 顏料

含有豐富黑色素或黑色色素的組織，如含鐵血黃素，可降低免疫細胞化學反應的信噪比。如果色素與所檢查的 Ag 存在于同一細胞中，則可能無法解釋?；蛘?，可以使用產(chǎn)生不同顏色沉淀物的檢測系統(tǒng)。另一種可能性是使用高錳酸鉀來阻斷黑色素，但這會損害某些表位。這種治療的替代方法是在免疫反應完成后使用吉姆薩染色或 Azure B 染料作為復染劑;黑色素會染成綠色或藍綠色，DAB產(chǎn)品將保持棕色。

對于含鐵血黃素，在pH 5.0乙酸鹽緩沖液中加入1%的連二亞硫酸鹽溶液5分鐘可完全消除含鐵血黃素并降低背景。

 主 營 項 目 

1

動物實驗

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2

細胞實驗

CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4

蛋白實驗

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實驗

HE染色、免疫組學、電鏡

6

生理生化實驗

肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養(yǎng)指標、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學實驗

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實驗

方案設(shè)計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

END

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