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樣本制備注意事項(xiàng)

1、根據(jù)不同的檢測細(xì)胞調(diào)整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養(yǎng)環(huán)境，注意一定要無菌的環(huán)境培養(yǎng)。

2、培養(yǎng)細(xì)胞時，以對數(shù)期處理為宜，避免細(xì)胞量過少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。

3、流式檢測細(xì)胞周期上機(jī)檢測所需收集細(xì)胞量較多，收集細(xì)胞時盡量多收集一些

4、流式檢測對細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地?fù)p傷、弄破細(xì)胞。

5、本實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地?fù)p傷細(xì)胞。

6、細(xì)胞周期待測細(xì)胞盡量要獲得單個細(xì)胞，避免DNA的降解。

7、樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。

8、污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。

9、染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護(hù)。

流式檢測時的注意事項(xiàng)

01

固定時必須預(yù)冷PBS重懸打入無水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細(xì)胞形成團(tuán)塊。

02

固定后細(xì)胞雖然可以保存較長時間后再上機(jī)檢測，為避免不可控因素影響最好盡早上機(jī)檢測。

03

進(jìn)樣速度：一般檢測細(xì)胞濃度調(diào)整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進(jìn)樣速度太快。

04

儀器質(zhì)控定期做，檢查質(zhì)控微球的CV值，盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬。

05

通過電壓脈沖信號的寬度、高度、面積等參數(shù)區(qū)別實(shí)體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體，最大程度的減少粘連細(xì)胞帶來的假陽性結(jié)果。

06

選擇合適的細(xì)胞系，不同的細(xì)胞系由于細(xì)胞形態(tài)、直徑等不同，會對結(jié)果的美觀程度有一定的影響，筆者常用HeLa細(xì)胞系，峰形較細(xì)，周期各階段明顯區(qū)別，結(jié)果美觀。

07

建議選擇6孔板操作，細(xì)胞給藥密度在40%左右，給藥時間不一定要與蛋白印跡法給藥時間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達(dá)的變化，例如給藥10小時，蛋白上可見明顯變化趨勢，但10小時收樣時，孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯觀察到細(xì)胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結(jié)果會有很大的影響。流式細(xì)胞術(shù)收樣時，盡量保證孔內(nèi)細(xì)胞還未漂浮。

08

收樣時，如果孔內(nèi)已經(jīng)有細(xì)胞漂浮，細(xì)胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時間必須嚴(yán)格控制，及時終止消化，消化時間太久，容易對細(xì)胞造成損傷和死亡。

09

收集細(xì)胞時，離心機(jī)選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預(yù)冷的PBS，將管內(nèi)的細(xì)胞混勻后，再加入0.7 mL預(yù)冷的無水乙醇，4℃固定過夜。整個收樣過程中，不要用槍頭劇烈吹打細(xì)胞，一是會損傷細(xì)胞，二是造成細(xì)胞損失。

10

上機(jī)前，離心機(jī)選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時格外需要注意的是由于不同時期細(xì)胞的重量不一樣，離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會存在大量細(xì)胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機(jī)測試前最好使用200目篩網(wǎng)過篩，以免細(xì)胞聚集堵塞機(jī)器管道。

細(xì)胞周期檢測常見問題解答與處理

問

細(xì)胞量太少，得不到數(shù)據(jù)結(jié)果白做了咋辦?

答

待測的細(xì)胞已經(jīng)制備完了太少不容易挽救，正確的操作方法如下:

1)要保證收集足夠的細(xì)胞樣品(個人經(jīng)驗(yàn)至少收集100萬左右);如果藥物處理后細(xì)胞死亡過多，應(yīng)該降低藥物濃度;

2)固定細(xì)胞時先用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，再逐滴滴入無水乙醇中;

3)細(xì)胞清洗時，不可過度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片;

4)最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機(jī)，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點(diǎn)，不要吸完。

問

可不可以用70~75%乙醇直接固定細(xì)胞，反正乙醇固定細(xì)胞的終濃度也是這么多?

答

不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞，影響固定效果，甚至容易導(dǎo)致固定后無細(xì)胞沉淀的現(xiàn)象。

正確做法是:待細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙

醇。

問

在測定細(xì)胞周期的時候,由于固定、消化等處理后會出現(xiàn)很多細(xì)胞碎片，影響測量結(jié)果，無法找到G1期細(xì)胞群怎么辦?

答

在測定細(xì)胞周期的時候，除了設(shè)苦好獲取數(shù)據(jù)的模版外，另外設(shè)置直方圖，測量模式為線性放大，調(diào)整放大倍數(shù)，使二倍體峰出現(xiàn)在橫坐標(biāo)50道的位置，就很容易的找到了二倍體峰和細(xì)胞周期個時相細(xì)胞的分布情況。

問

做流式分析細(xì)胞周期時，收集了10^6左右的細(xì)胞，但是固定后沒有細(xì)胞沉淀，甚至 PBS 洗滌后上機(jī)已經(jīng)沒有細(xì)胞了，哪個環(huán)節(jié)出了問題?

答

確定收集了足量細(xì)胞但是沒有細(xì)胞沉淀且上機(jī)沒看見待測細(xì)胞的話，應(yīng)該洗滌過程中細(xì)胞丟失了。

1)盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)

2)離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒，吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。

3)離心的轉(zhuǎn)速或時間可以適當(dāng)增加。

4)每次加試劑時，吸頭最好不要接觸液面，混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。

問

什么樣的數(shù)據(jù)可以用?

答

1)G2/M期細(xì)胞的DNA 含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個2倍于G1信號峰的高斯峰。

2) CV(變異系數(shù))表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認(rèn)可。

3) RCS 最好是在1~3，高于5則不被認(rèn)可。RCS高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時候RNA 酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。

問

怎樣提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分辨率和精確度?

答

變異系數(shù)(Coefficient of Variation，CV值)反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品 CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。細(xì)胞碎片越少、細(xì)胞聚團(tuán)越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高 G0/G1峰分辨率和精確度。

主營項(xiàng)目

1

動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3

分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4

蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5

病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6

生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7

多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8

整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

END

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