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干貨分享 | get這些常規(guī)細胞實驗，高分文章穩(wěn)了（下）

前幾期帶大家了解過一些常規(guī)的細胞實驗【干貨分享 | get這些常規(guī)細胞實驗，高分文章穩(wěn)了（上）】，相信對大家課題研究方面還是有一些幫助的，今天再給大家整理一波，一起來看看吧~

細胞遷移和侵襲

在腫瘤發(fā)展過程中，細胞進入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對象。相關的信號通路主要可以分為控制細胞黏附和控制細胞骨架。細胞的遷移與侵襲主要與細胞骨架和黏附相關。腫瘤細胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進行檢測。細胞劃痕也是測定腫瘤細胞運動特性的方法，由于無法區(qū)別正常增殖和遷移細胞，應用有局限性。

1.Transwell實驗

Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞。應用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

腫瘤遷移實驗：研究腫瘤細胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

腫瘤侵襲實驗：研究腫瘤細胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計數(shù)進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力?！?/p>

?目的：研究目的基因過表達/干擾對細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

?材料：正常細胞、對照慢病毒、過表達基因慢病毒

?步驟：細胞復蘇——Transwell鋪板——細胞培養(yǎng)及染色——拍照

?結果：

2. 劃痕實驗：

劃痕實驗檢測細胞遷移的原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。

實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。

細胞周期檢測

細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期反應了細胞增殖速度，單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

原理：細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的 G0/G1期具有二倍體細胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細胞內(nèi)DNA 和RNA 結合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞術檢測到的與DNA 結合的PI 的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。

因此，通過流式細胞術PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。

?目的：通過慢病毒感染獲得基因過表達的細胞株，利用PI染色法結合流式細胞術檢測各組細胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)毎芷诘挠绊憽?/p>

?材料：目的細胞、病毒

?步驟：細胞準備——樣品收集——上機檢測——數(shù)據(jù)分析

?結果：

細胞克隆實驗

細胞克隆實驗原理：單個細胞在體外增殖6代以上（時間約1周以上），其后代所形成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)， 但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細胞才會形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣毎莫毩⑸婺芰Φ膹娙?，用于評價細胞群體依賴性和增殖能力。

由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

?目的：通過目的基因過表達/干擾細胞組、空細胞組與陰性對照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計學分析，研究基因?qū)毎后w依賴性和增殖能力的影響。

?材料：病毒和細胞株

?步驟：鋪板——細胞培養(yǎng)——觀察克隆，染色，計算克隆形成率

?結果：

細胞粘附實驗

細胞粘附實驗實驗原理：細胞黏附性是維持組織結構穩(wěn)定的基本條件，也是細胞運動和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對細胞的增殖、分化有重要影響。通?？煞譃閮深悾醇毎c細胞黏附和細胞與基質(zhì)黏附。

機體內(nèi)許多細胞，如上皮細胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細胞，如白細胞，活躍運動，就需要不斷調(diào)節(jié)細胞黏附。細胞黏附性的改變在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴散的能力，提示這些細胞在相互識別及黏附機制方面發(fā)生了改變。

實驗方法：

1、將4.5×105個Hep3B細胞/孔傳代于無菌6孔培養(yǎng)板中。

2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細胞（兩個平行孔，Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7），轉(zhuǎn)染后的細胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細胞。同時各有兩個平行孔的細胞進行陰性對照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。?

3、培養(yǎng)48小時后收集細胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細胞（約1×106個）從壁上消化下來并制成單細胞懸液。?

4、用無血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。

5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul，放于超凈臺中風干過夜。?

6、96孔板每孔加入適量無血清MEM細胞培養(yǎng)液(或PBS或生理鹽水)，放置60－90分鐘，洗去多余的膠；?

7、取轉(zhuǎn)染、陰性對照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞以4×103/孔接種在鋪膠的96孔板中，設3個重復孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)20min、40min、60min。?

8、在相應時間點取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，洗去未粘附細胞。

9、每孔加入100?ul甲醇，固定15min。?

10、每孔加入100?ul姬姆薩染液，染色15min，蒸餾水洗去染液。?

11、在200倍顯微鏡下計數(shù)粘附細胞數(shù)量（每孔在固定位置取8個視野）。

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