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免疫熒光染色技術(shù)依賴于抗原抗體相互作用的極高特異性。通過將不影響抗原抗體功能的熒光染料標(biāo)記在抗體或抗原上，當(dāng)標(biāo)記的抗體與其對(duì)應(yīng)的抗原特異性結(jié)合時(shí)，可在熒光顯微鏡下觀測(cè)到一種特異的熒光信號(hào)，從而判定抗原的存在、散布和位置。今天，小編將與大家探討免疫熒光染色中抗體的選擇方法，希望能對(duì)大家有所幫助。

免疫熒光染色一抗的挑選

①依據(jù)樣本挑選一抗
一抗的物種來(lái)源應(yīng)盡量避免與檢測(cè)樣本的物種相同，以防止二抗與樣本內(nèi)生的免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。例如，若檢測(cè)的是小鼠樣本，那么一抗應(yīng)避免選用小鼠或大鼠來(lái)源，而應(yīng)考慮如兔來(lái)源等其他物種的一抗。這樣，在選擇二抗時(shí)便可選用抗兔的二抗，從而規(guī)避交叉反應(yīng)的問題。

②確認(rèn)抗體檢測(cè)目標(biāo)即為研究目標(biāo)蛋白
在免疫熒光染色或其他抗體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，由于同一蛋白可能存在多個(gè)不同的名稱或同義詞，因此，確保所選抗體的檢測(cè)對(duì)象與我們研究的目標(biāo)蛋白完全一致是極為關(guān)鍵的。為避免因命名混淆而引發(fā)的實(shí)驗(yàn)誤差，一個(gè)簡(jiǎn)單且有效的方法是通過對(duì)比UniProt ID來(lái)驗(yàn)證抗體的特異性。同時(shí)，所選抗體的說明書需明確表明適用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，即IF。

如我想對(duì)PGC-1α進(jìn)行標(biāo)記，我在Abcam搜索PGC1a，找到的結(jié)果顯示可進(jìn)行IF染色，便可選擇，接著我們需考慮物種來(lái)源等其他要求。

③確定抗體的反應(yīng)物種
在選擇一抗時(shí)，我們首先要仔細(xì)研讀抗體的產(chǎn)品說明書。說明書中會(huì)清晰列出抗體的反應(yīng)物種，即該抗體能夠識(shí)別的物種或類別。我們所選的抗體必須能夠識(shí)別我們樣本的物種。例如，若樣本是小鼠組織，那么需選用一種能夠識(shí)別并結(jié)合小鼠組織中小鼠蛋白的一抗。若需進(jìn)行多種抗體標(biāo)記，則還需考慮一抗選用不同的物種來(lái)源。

④何謂預(yù)測(cè)可檢測(cè)的物種？
在抗體選擇過程中，有時(shí)會(huì)在產(chǎn)品說明書上看到“預(yù)測(cè)可與哪些物種反應(yīng)”（Predicted to react with）這樣的表述。這通常是廠家基于目標(biāo)蛋白在不同物種間的相似性進(jìn)行的一種預(yù)測(cè)，意味著抗體可能能夠識(shí)別并結(jié)合這些預(yù)測(cè)物種中的相似蛋白。由于這種預(yù)測(cè)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，廠家通常不會(huì)為這類抗體的性能提供保證。

免疫熒光染色二抗的挑選

①二抗的物種來(lái)源需與一抗相匹配
若一抗是兔來(lái)源的，那么應(yīng)選用識(shí)別兔IgG的二抗，即anti-rabbit IgG。

②依據(jù)一抗類型與亞類
當(dāng)一抗是多克隆抗體（多抗），如來(lái)源于兔、山羊等，且為IgG同型時(shí)，二抗一般選用抗IgG(H+L)的。這是因?yàn)槎嗫寺】贵w由多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，它們識(shí)別的是抗原上的多個(gè)表位，且它們的重鏈和輕鏈都可能參與抗原的結(jié)合。因此，選用抗IgG(H+L)的二抗可確保與一抗的Fc段（包含重鏈恒定區(qū)）以及可能涉及的輕鏈部分均有良好的結(jié)合。

當(dāng)一抗是單克隆抗體（單抗），來(lái)源為小鼠IgG1時(shí)，可選用Anti-Mouse IgG1的二抗，這樣的二抗僅針對(duì)小鼠IgG1的亞類，具有高度的特異性。然而，在某些情況下，為增加實(shí)驗(yàn)的靈活性和兼容性，也可選用anti-mouse IgG(H+L)的二抗。這種二抗能夠識(shí)別小鼠IgG的重鏈和輕鏈，因此不僅適用于IgG1亞類，也適用于其他小鼠IgG亞類（如IgG2a、IgG2b等），從而拓寬了其實(shí)驗(yàn)應(yīng)用范圍。

③熒光染料的選擇
若實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行多重檢測(cè)，即同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，那么需選用光譜不重疊且穩(wěn)定明亮的熒光染料。這樣可確保每個(gè)目標(biāo)都能被獨(dú)立且清晰地檢測(cè)到。免疫熒光三標(biāo)可選用488、555、647。

舉例分析
免疫熒光三標(biāo)選擇抗體：
①三種一抗物種來(lái)源各異，如分別選用來(lái)源于豬、小鼠、兔的。

②三種二抗的物種來(lái)源最好是相同的，且不同于任何一種一抗，此處便可選用Goat-anti-pig 488、Goat-anti-mouse-555、Goat-anti-rabbit-647。

其他的選擇要求自行判定，免疫熒光多重染色選擇抗體可能較為困難，可考慮采用TSA技術(shù)。

補(bǔ)充一下：需明確你的研究對(duì)象是何種，是細(xì)胞表面的蛋白，還是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子？不同的抗體針對(duì)不同的靶標(biāo)，需選用正確的抗體。

如有實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題，可咨詢我們

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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