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Western Blot雖是實(shí)驗(yàn)室最常用的蛋白分析技術(shù)，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長(zhǎng)、影響因素多，所以，導(dǎo)致我們?cè)谧鰧?shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)遇到各式各樣的問(wèn)題。今天我們總結(jié)了一些WB實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的各種“奇葩”條帶問(wèn)題，并為你推薦了常用的解決方法，希望對(duì)大家有所幫助。

一、目標(biāo)條帶沒(méi)有信號(hào)

原因分析：    

樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。

解決方法： 添加蛋白酶抑制劑。

原因分析：    

目標(biāo)蛋白濃度過(guò)低（低于檢測(cè)下線(xiàn)）。

力

 解決方法：

加大上樣量或提高目標(biāo)蛋白濃度。
 原因分析：

轉(zhuǎn)膜時(shí)間太短導(dǎo)致目標(biāo)蛋白沒(méi)有充分轉(zhuǎn)移到膜上，或者轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)穿。

解決方法：

 控制轉(zhuǎn)膜時(shí)間并選擇適合的轉(zhuǎn)印膜。
原因分析：

 一抗的特異性不佳，導(dǎo)致一抗無(wú)法識(shí)別目標(biāo)蛋白。

解決方法：

 選用高品質(zhì)抗體。
  原因分析：

一抗反復(fù)使用后導(dǎo)致效價(jià)降低，盡管還能與目標(biāo)蛋白連接，但連接蛋白的數(shù)量太    一抗不宜反復(fù)使用。

 洗脫過(guò)渡導(dǎo)致與一抗相結(jié)合的目標(biāo)蛋白被洗掉。 

  解決方法：

 洗脫時(shí)間的時(shí)間和頻率應(yīng)有效控制，一般建議3次10分鐘。

二. 圖片背景過(guò)高，難以分辨條帶

原因分析及 解決方法    

一抗?jié)舛忍?，?dǎo)致抗體非特異性結(jié)合。    降低一抗?jié)舛取?br/>    

洗膜的時(shí)間和次數(shù)不夠，導(dǎo)致其他蛋白沒(méi)有清洗干凈

   提高洗脫時(shí)間和頻率。
   

封閉物用量不足。

   提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒(méi)轉(zhuǎn)印膜。
   

封閉物使用不當(dāng)。    檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉。
   

封閉時(shí)間不夠。    室溫37度封閉1小時(shí)以上，4度封閉過(guò)夜。
   

一抗稀釋度不適宜。    對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
   

一抗孵育的溫度偏高。    建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
   

三、 膜上出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑斑

原因分析及解決方法
   

膜上其他部位與一 抗或二抗非特異性結(jié)合，配置的封閉液可能沒(méi)有完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時(shí)候膜上形成黑點(diǎn)。

 配置封閉液后最好靜止一下，封閉牛奶一定要純，封閉結(jié)束之前要清洗三遍之后再加一抗。
    

抗體與封閉試劑反應(yīng)。    

使用前過(guò)濾封閉試劑。
   

HRP偶聯(lián)二 抗中有聚集體。  

  過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體。
   

四、出現(xiàn)非特異性條帶

原因分析    解決問(wèn)題    

一抗非特異性與蛋白結(jié)合，此種情況大多數(shù)情況是因?yàn)橐豢固禺愋圆缓谩?  

 更換一抗。    

目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，有些一抗還能結(jié)合其他蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。 

 更換一抗品種。
   

蛋白樣品降解，蛋白酶將目標(biāo)蛋白分解成若千個(gè)蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識(shí)別。  

 添加蛋白酶抑制劑。

五、條帶中出現(xiàn)整條白色空斑

原因分析    解決問(wèn)題    

過(guò)高的蛋白上樣量或一抗和二抗?jié)舛冗^(guò)高都會(huì)促使底物過(guò)快的消耗，導(dǎo)致我們?cè)谧龌瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)，發(fā)光底物已經(jīng)消耗殆盡而形成空斑。   

 減少蛋白上樣量、稀釋一抗和二抗的濃度。    

六、條帶中出現(xiàn)白圈

原因分析    解決方法    

轉(zhuǎn)膜時(shí)候，膜與膠之間有氣泡。   

解決方法:  制作“三明治”時(shí)，注意趕走氣泡。通常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤(pán)子里，液體高度與第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆一些轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗后平鋪在濾紙上，隨后在確認(rèn)濾紙與膠之間無(wú)氣泡后，再往膠上澆一些電轉(zhuǎn)液，之后用雙手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜兩側(cè)中間，使膜成U型，再將U型底部接觸到膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣可以減少氣泡。上層濾紙同樣用U型的放置方法，可以用玻璃棒貼實(shí)一下，然后蓋上海綿墊。
   

七、條帶拖尾

原因分析    解決方法    

這種情況很容易出現(xiàn)，因?yàn)閷?dǎo)致條帶拖尾的原因很多，可能性較大的是一抗?jié)舛忍撸饔脮r(shí)間太長(zhǎng)或。   

根據(jù)情況調(diào)整蛋白量，同時(shí)降低一抗的濃度，縮短一抗的時(shí)間。    

八、條帶變形

原因分析    解決問(wèn)題
   

膠體中存在氣泡，或不溶性雜質(zhì)，膠不均不平整。  

  配膠時(shí)用的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無(wú)雜質(zhì)。貼邊角加入液體，凝固時(shí)避免大幅度動(dòng)作觸碰。    

九、條帶呈啞鈴裝

原因分析及 解決方法    

出現(xiàn)啞鈴裝條帶的問(wèn)題，最大的可能性就是膠沒(méi)有配置好，膠凝固后不均一。另外還有一種可能就是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒(méi)有離心下來(lái)，然后雜質(zhì)沉淀在孔的中間，蛋白被擠到兩邊。  

  解決方法：把膠配好，不合格的膠堅(jiān)決不能用。    

十、最邊緣條帶彎曲

原因分析    解決方法    

電泳電流不均一   

解決方法：換電泳槽，或者不使用兩邊的孔。

十一、背景非均一性

原因分析及 解決方法    

膜可能干過(guò)。    

解決方法：在每一步的操作過(guò)程中，都需要注意不要讓膜干掉，確保蛋白面不要被風(fēng)干很長(zhǎng)時(shí)間，一定要用不漏水的封閉盒并蓋上蓋子，防止過(guò)夜16個(gè)小時(shí)液體流失。    

十二、條帶呈“微笑”或“倒微笑"”狀

原因分析及解決問(wèn)題    

條帶呈“微笑U”狀，凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。   

解決方法： 更換電泳槽。
   

條帶呈“倒微笑∩”裝，凝膠左右兩頭沒(méi)有凝固好。
解決方法： 重新制膠。    

十三、其他問(wèn)題

原因分析及解決方法    

蛋白分子量偏高或者偏低。
  

 可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對(duì)應(yīng)，比如說(shuō)100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說(shuō)20KD的蛋白你用6%的膠跑。
   

蛋白質(zhì)降解。

   蛋白質(zhì)降解后很可能會(huì)在比原來(lái)位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會(huì)出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點(diǎn)是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。
   

所有條帶連成一片沒(méi)有間隔。

   原因最可能是上樣量過(guò)多，其次是樣品彌散（比如電泳長(zhǎng)時(shí)間停止樣品彌散）。
   

以上是我們對(duì)WB條帶出現(xiàn)各種狀況及解決方法的一個(gè)總結(jié)，希望可以對(duì)大家有所幫助。如果各種原因都試變了，還是做不好WB實(shí)驗(yàn)怎么辦？

跑出漂亮條帶的秘訣，你學(xué)會(huì)了嗎？

如有實(shí)驗(yàn)技術(shù)問(wèn)題，可咨詢(xún)我們

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