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以外泌體（或者胞外囊泡）及其成分（如RNA、脂質(zhì)和蛋白）、線粒體轉移（比如隧道納米管介導的）、配體-受體（比如膜配體、分泌性配體以及膜受體）為代表的“細胞-細胞間通訊（Cell-Cell Communication，CCC）”是很多研究團隊關注的主題，也是這幾年國自然項目和高分文章經(jīng)常關注的領域。今天來盤點這三種作用方式的研究方法。

 01

外泌體介導的細胞間通訊

外泌體是細胞分泌的納米級囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、RNA等生物分子，通過與受體細胞融合或被內(nèi)吞，傳遞信號調(diào)節(jié)其功能。

研 究 方 法

（1）外泌體分離、鑒定和表征方法

外泌體分離常用差速超速離心、密度梯度超速離心、過濾、超濾等傳統(tǒng)方法，也可用微珠、微流控芯片等新技術。鑒定時需檢測外泌體的蛋白標志物，如CD9、CD63、CD81等，常用Western blot。表征包括形態(tài)和粒徑分布，可使用透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）等。

（2）外泌體示蹤細胞間傳遞方法

示蹤方法包括熒光染料標記，如PKH26、PKH67等，可直接與外泌體脂質(zhì)雙層膜結合；核酸標記，將外泌體核酸標記為熒光或放射性探針；蛋白質(zhì)標記，用GFP等標記外泌體表面蛋白；還可利用磁性納米顆粒標記，通過磁共振成像追蹤。

（3）外泌體成分的組學分析

外泌體組學分析主要包括蛋白質(zhì)組學、轉錄組學和脂質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學通過質(zhì)譜技術分析外泌體中的蛋白質(zhì)組成；轉錄組學利用高通量測序技術研究外泌體中的RNA種類和表達水平；脂質(zhì)組學采用質(zhì)譜技術分析外泌體中的脂質(zhì)組成。

（4）外泌體與受體細胞共培養(yǎng)方法

將提取純化的外泌體加入受體細胞培養(yǎng)液中，通過觀察受體細胞的反應和表型來研究外泌體對受體細胞的影響。此外，也可標記外泌體后進行共培養(yǎng)，實時監(jiān)測其在受體細胞中的動態(tài)變化。

 02

線粒體轉移

線粒體可通過隧道納米管（TNTs）、細胞外囊泡或直接細胞外釋放等方式從一個細胞轉移到另一個細胞，支持受體細胞的代謝需求。

研 究 方 法

（1）線粒體分離和鑒定

線粒體分離通常采用差速離心法，先低速離心去除細胞碎片和核，再高速離心沉淀線粒體。鑒定方法包括透射電子顯微鏡（TEM）觀察其雙層膜結構，以及通過特異性抗體（如抗TOM20抗體）進行Western blot檢測。

（2）分離線粒體后與細胞共培養(yǎng)

將分離的線粒體加入受體細胞培養(yǎng)液中，通過熒光顯微鏡或流式細胞術觀察線粒體是否被攝取。也可利用化學誘導供體細胞線粒體耗竭后與受體細胞共培養(yǎng)，比較處理前后受體細胞的差異。

（3）細胞共培養(yǎng)體系下的線粒體標記和示蹤

使用熒光染料（如MitoTracker）或熒光蛋白（如GFP）標記供體細胞的線粒體，然后與受體細胞共培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察線粒體在受體細胞中的分布，從而示蹤線粒體轉移。

（4）單細胞測序結合MERCI分析

獲取共培養(yǎng)的癌細胞和T細胞的轉錄組數(shù)據(jù)后，應用MERCI算法識別線粒體突變（mtSNVs）并估計癌細胞中外源線粒體的相對豐度。通過比較突變頻率，確定T細胞特有的突變，將細胞分類為潛在的線粒體供體和受體。并通過計算DNA和RNA排名分數(shù)，預測線粒體的受體細胞和供體細胞。

 03

配體-受體結合

配體與受體結合后，誘導受體構象變化，激活下游信號通路，調(diào)節(jié)細胞功能。

研 究 方 法

（1）阻斷性抗體阻斷受體活化

使用針對受體特定區(qū)域的阻斷性抗體，該抗體可特異性結合受體，阻止配體與受體結合，從而抑制受體的活化。通過檢測下游信號通路的激活情況（如蛋白磷酸化水平），評估阻斷效果，用于研究受體活化的功能和信號傳導機制。

（2）中和性抗體降低配體濃度

利用中和性抗體與配體特異性結合，形成抗體-配體復合物，從而降低游離配體的濃度。通過檢測細胞對配體的反應（如細胞增殖、細胞因子分泌等），評估中和效果，用于研究配體在生理過程中的作用和調(diào)控機制。

（3）配體-與受體在組織與細胞共培養(yǎng)體系下的染色與共定位

在共培養(yǎng)體系中，分別用熒光標記的抗體對配體和受體進行染色。通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察兩者的熒光信號，分析其共定位情況。共定位分析可借助軟件計算共定位系數(shù)，判斷配體與受體是否在同一細胞區(qū)域聚集，從而推斷二者在生理條件下的相互作用。

（4）免疫共沉淀驗證配體-與受體結合

將細胞裂解后，加入針對受體的特異性抗體，孵育使抗體與受體結合。再加入蛋白A/G瓊脂糖珠，通過抗體與珠子結合沉淀受體蛋白復合物。最后通過Western blot檢測沉淀物中是否存在配體蛋白，若檢測到配體，則說明二者在細胞中存在結合。

（5）表面等離子共振檢測配體-受體結合

強度將受體固定在SPR芯片表面，配體在流動相中通過芯片表面。SPR技術可實時監(jiān)測配體與受體結合過程中的折射率變化，從而獲得結合親和力（KD）、結合速率常數(shù)（ka）和解離速率常數(shù)（kd）等動力學參數(shù)，用于定量分析二者的結合強度。

（6）分析配體與受體結合后受體構象改變

通過圓二色光譜（CD）或核磁共振（NMR）等技術，檢測受體在結合配體前后的構象變化。CD可分析二級結構變化，NMR可提供更詳細的三維結構信息。此外，也可利用熒光共振能量轉移（FRET）技術，通過熒光標記的探針檢測受體內(nèi)部距離變化，間接反映構象改變。

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