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體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是我們開展課題研究及進(jìn)行生物醫(yī)藥醫(yī)學(xué)研究非常重要的途徑。

今天整理了多種體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的干貨共大家學(xué)習(xí)和參考：MPC5足細(xì)胞缺氧模型、脊索樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化成髓核樣細(xì)胞、人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(hiPSC)誘導(dǎo)分化成脊索樣細(xì)胞、大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)模型、3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)模型、乳鼠二型肺泡上皮細(xì)胞(AECII)分離提取。

LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型

1. 實(shí)驗(yàn)背景

脂多糖(Lipopolysaccharide)(英文簡(jiǎn)寫LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，是由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的物質(zhì)(糖脂質(zhì))。脂多糖由三部分組成:類脂A、核心多糖、O-抗原。LPS中的類脂A部分作為脂質(zhì)雙分子層外層的組成部分進(jìn)入到脂質(zhì)層中，糖鏈部分暴露在細(xì)胞外面，然后以這種形式存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞表面。在LPS的生理活性表現(xiàn)中被認(rèn)為起到最重要作用的是類脂A部分，類脂A可以單獨(dú)體現(xiàn)其生理作用 。LPS很難從細(xì)胞壁脫落，當(dāng)細(xì)菌死亡等時(shí)它會(huì)通過溶解、破壞細(xì)胞來脫落，并通過作用于動(dòng)物細(xì)胞等而發(fā)揮其毒性。由于這種性質(zhì)，它不是細(xì)菌分泌到體外的毒素(外毒素)，而是不被分泌的"存在于細(xì)菌體內(nèi)的毒素"，所以又被稱為內(nèi)毒素。

內(nèi)毒素模型是將純化的LPS直接注射人動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建的，由于其致病因素單一、能夠排除其他影響因素，而成為研究細(xì)菌感染單一成分在感染引起的炎癥反應(yīng)中的發(fā)病機(jī)制的理想模型1。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁最外層的一層較厚(8~10nm)的類脂多糖物質(zhì)，因其在免疫調(diào)節(jié)方面的特性而成為醫(yī)學(xué)研究的興趣點(diǎn)。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：RWPE-1細(xì)胞。

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清、PBS、RWPE-1細(xì)胞專用培養(yǎng)基、

3. 實(shí)驗(yàn)操作

① 取LPS粉末溶于無菌水使其母液濃度為5mg/ml，0.22um過濾器過濾；

② 用細(xì)胞專用培養(yǎng)基稀釋LPS母液；

③ 細(xì)胞鋪板24h后，棄上清加入配制好的LPS溶液；

④ 37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h；

⑤ 檢測(cè)相應(yīng)炎癥指標(biāo)。

4. 評(píng)價(jià)方法

① ELISA檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)(IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α等)；

② 試劑盒檢測(cè)ROS、LDH、SOD、MDA等；

③ 流式/免疫熒光檢測(cè)ROS、JC-1等；

④ PCR/WB檢測(cè)炎癥因子基因和蛋白水平的表達(dá)等。

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① LPS可溶于DMSO，也可溶于水，為了減少溶劑對(duì)細(xì)胞的影響，可選擇水去溶解LPS，最大溶解度為5mg/ml；

② LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，一定濃度誘導(dǎo)細(xì)胞不一定會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡的情況，因此不宜選用CCK8法去選擇LPS造模濃度，可選擇檢測(cè)多個(gè)炎癥因子去篩選濃度；

③ 不同廠家品牌的LPS貨號(hào)不同引起的炎癥反應(yīng)不一定相同，還需客戶自己選擇。

MPC5足細(xì)胞缺氧模型

1. 實(shí)驗(yàn)背景

正常情況下，細(xì)胞體外培養(yǎng)需5%CO2與95%空氣環(huán)境，然而，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓或使細(xì)胞用氧障礙可以造成缺氧狀態(tài)，目前常用的缺氧方法有物理性缺氧法和化學(xué)性缺氧法。

① 物理性缺氧法：通過降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓造成細(xì)胞缺氧性損傷，類似于體內(nèi)發(fā)生的低張性缺氧。

② 化學(xué)性缺氧法：在培養(yǎng)基中加入化學(xué)物質(zhì)，造成細(xì)胞用氧障礙或使培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣耗盡，如在培養(yǎng)基內(nèi)加人氰化物、連二亞硫酸鈉等?；瘜W(xué)缺氧模型制備簡(jiǎn)單，但由于添加的物質(zhì)可能會(huì)改變培養(yǎng)基的化學(xué)成分，且添加劑本身對(duì)細(xì)胞有損傷作用，增加了實(shí)驗(yàn)的混雜因素，需慎重選用。

③ 聯(lián)合缺氧法：2種或2種以上方法聯(lián)合使用可使細(xì)胞缺氧更為明顯。例如：在培養(yǎng)基中添加連二亞硫酸鈉，然后，將細(xì)胞放入95%N2+5%CO2密閉容器中，連二亞硫酸鈉已使培養(yǎng)基內(nèi)氧氣耗盡，再置入無氧外環(huán)境即可造成穩(wěn)定的細(xì)胞缺氧。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：MPC5細(xì)胞       

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、三氣培養(yǎng)箱

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清、PBS、DMEM培養(yǎng)基、CCK8

3. 實(shí)驗(yàn)操作

① 細(xì)胞鋪兩塊96孔板，

② 37℃，5%CO2箱中孵育24h后，細(xì)胞換液；

③ 將其中一塊96孔板放置在設(shè)置缺氧的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

④ 培養(yǎng)至低氧細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷后分別取出96孔板；

⑤ 吸去培養(yǎng)基，向每孔中加入100μL CCK-8混合液；37℃，5%CO2箱中孵育1-2h；

⑥ 酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

4.評(píng)價(jià)方法

① CCK8檢測(cè)；

② 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① 細(xì)胞經(jīng)過常氧與低氧處理時(shí)，要控制好兩塊培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞密度，必須同時(shí)鋪板，保持細(xì)胞密度一致。

② 細(xì)胞鋪板后需要在常氧下穩(wěn)定培養(yǎng)24h，使其細(xì)胞能正常貼壁生長(zhǎng)，24h后需同時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基后在進(jìn)行常氧與缺氧分別處理。

③ 低氧模型時(shí)間長(zhǎng)短需要實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞是否有損傷，不同的細(xì)胞缺氧模型的氧濃度和細(xì)胞損傷時(shí)間還需以具體實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。

脊索樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化成髓核樣細(xì)胞

1. 實(shí)驗(yàn)背景

椎間盤再生研究中，脊索細(xì)胞獨(dú)特的生理功能受到關(guān)注。成人髓核內(nèi)脊索細(xì)凋亡與髓核內(nèi)蛋白多糖含量降低、膠原含量增加、水含量丟失相關(guān).脊索細(xì)胞分泌的可溶性因子具有引導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞向髓核遷移，調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞蛋白多糖合成的作用。脊索細(xì)胞可促進(jìn)髓核軟骨樣細(xì)胞增殖和表型維持，在維持髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外基質(zhì)含量中起著重要作用。脊索細(xì)胞獨(dú)特的生理功能，在組織工程修復(fù)退變椎間盤研究中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：脊索樣細(xì)胞。     

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)。

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、hiPSC細(xì)胞專用培養(yǎng)基、ITS、NEAA、抗壞血酸、L-脯氨酸、地塞米松及TGF-β3。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

采用含有1%的ITS、1%的NEAA、1%的青鏈霉素、50ug/ml抗壞血酸、40ug/ml的L-脯氨酸、10nM的地塞米松及10ng/ml的TGF-β3的DMEM-HG培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，細(xì)胞誘導(dǎo)15天以上，實(shí)時(shí)觀察拍照。

4. 評(píng)價(jià)方法

① 可測(cè)定空泡細(xì)胞；

② 流式細(xì)胞熒光分選空泡細(xì)胞的GD2/TIE2的表型；

③ 免疫熒光染色分析各組細(xì)胞中GD2（雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2）、TIE2（TEK受體酪氨酸激酶2）、II型膠原、aggrecan、T及NOTO的表達(dá)。

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① 細(xì)胞誘導(dǎo)過程中需每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，已滿足細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求，若細(xì)胞出現(xiàn)較多死亡，及時(shí)更換成正常細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行過度。

② 細(xì)胞誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)，容易出現(xiàn)細(xì)胞扎堆情況，拍照時(shí)盡量選擇細(xì)胞單層生長(zhǎng)的區(qū)域去拍照。

③ 誘導(dǎo)后期鏡下觀察出現(xiàn)大量空泡細(xì)胞，即可收集樣本驗(yàn)證誘導(dǎo)是否成功。

人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(hiPSC)
誘導(dǎo)分化成脊索樣細(xì)胞

1.實(shí)驗(yàn)背景

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術(shù)是指通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞。分化的細(xì)胞在特定條件下被逆轉(zhuǎn)后，恢復(fù)到全能性狀態(tài)，或者形成胚胎干細(xì)胞系，或者進(jìn)一步發(fā)育成新個(gè)體的過程即為細(xì)胞重編程（Cell reprogramming）。分化是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，并沒有改變遺傳物質(zhì)，而重編程在某種意義上就是分化的一個(gè)逆轉(zhuǎn)。

與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同，iPSCs技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，因此沒有倫理學(xué)問題。此外，利用iPSCs技術(shù)可以用病人自己的體細(xì)胞制備專有的干細(xì)胞，從而大大降低了免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性。iPSCs的岀現(xiàn)，在干細(xì)胞、表觀遺傳學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響，使人們對(duì)多能性的調(diào)控機(jī)制有了突破性的新認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離。

iPSCs在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等臨床疾病治療等方面具有巨大的潛在價(jià)值。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：hiPSC細(xì)胞。

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)。

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、hiPSC細(xì)胞專用培養(yǎng)基、ACTIVIN A、CHIR、NOGGIN、AGN193109、FGF2。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

① 取hiPSC細(xì)胞復(fù)蘇和擴(kuò)培后測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，

② 當(dāng)細(xì)胞量密度大于5*105/cm2時(shí)，

③ 加入10ng/ml的ACTIVIN A，3uM的CHIR，50ng/ml的NOGGIN，10uM的AGN193109，及10ng/ml的FGF2處理細(xì)胞，

④ 培養(yǎng)到第5天左右，實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，

⑤ 收集爬片做免疫熒光驗(yàn)證等。

4. 評(píng)價(jià)方法

可用IF或qPCR分析細(xì)胞NOTO、T及FOXA1、Chordin、FOXJ1、Noggin、及SHH的表達(dá)，來評(píng)價(jià)脊索樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① 培養(yǎng)前一天，提前包被人多潛能干細(xì)胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，并加入適量復(fù)蘇完全培養(yǎng)基，置于5% CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞復(fù)蘇需使用復(fù)蘇專用培養(yǎng)基，可大大提高細(xì)胞的復(fù)蘇效率。復(fù)蘇過程中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞、吹打混勻和重懸細(xì)胞時(shí)，吹打力度要輕柔，并盡量減少吹打次數(shù)，細(xì)胞接種后，即刻在顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)塊的大小，4 ~ 10個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊為最佳。如果吹打力度過大或次數(shù)過多，導(dǎo)致細(xì)胞分散成單細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇率將偏低。

② 細(xì)胞培養(yǎng)需每天更換新鮮完全培養(yǎng)基，以滿足細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求，誘導(dǎo)過程中也需每天換液。

大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)模型

1. 實(shí)驗(yàn)背景

間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化是理解骨形成機(jī)制的有力工具，它也被用于鑒別骨質(zhì)疏松癥、骨修復(fù)和成骨不全等遺傳紊亂疾病。同其他組織器官一樣，骨組織也在不斷地進(jìn)行著細(xì)胞代謝，稱為骨代謝。它可以大致分為骨形成和骨重塑兩個(gè)階段，前者在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育期起主要作用，后者則持續(xù)整個(gè)生命周期。

成骨分化是骨生成的關(guān)鍵步驟，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)歷骨原細(xì)胞（osteoprogenitor cells）、成骨前體細(xì)胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨細(xì)胞（osteoblasts）和終末階段的骨細(xì)胞（osteocytes）的一個(gè)復(fù)雜的過程，其中涉及到多種類型細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，如信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、MicroRNA 等，形成了一個(gè)完整的骨代謝調(diào)控負(fù)反饋環(huán)路。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)。

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、100x雙抗、大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)分化試劑盒，茜素紅S染色液。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

① 當(dāng)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的融合度達(dá)到80-90%時(shí)，即可用0.25%胰酶進(jìn)行消化。

② 將消化下來的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞即時(shí)的生長(zhǎng)速度估算，接種一定量的細(xì)胞（接種后第二天的匯合度能達(dá)到70-80%）于6孔板中，每孔加入2ml專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

③ 將細(xì)胞置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

④ 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70-80%（或＞80%）時(shí)，小心將上清吸走，加入2ml大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

⑤ 每隔三天換用新鮮的大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

⑥ 誘導(dǎo)2-4周后，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況，使用茜素紅S染色液進(jìn)行鑒定。

4. 評(píng)價(jià)方法

茜素紅S染色：茜素紅S是一種蒽醌類衍生物，能和多種金屬離子螯合生成穩(wěn)定的橙紅色或深紅色的復(fù)合物，是一種良好的金屬指示劑，也可作為吸光度法測(cè)定金屬離子的顯色劑，還可作為酸堿指示劑，或用于極譜法測(cè)定金屬離子。在組織學(xué)和組織病理學(xué)中，由于茜素紅S可與碳酸鈣或磷酸鈣中的鈣鹽螯合形成橙紅色復(fù)合物，而常用于染色或定位組織中的鈣質(zhì)沉積。   

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)時(shí)，融合度盡量達(dá)到80%，或者更高，誘導(dǎo)時(shí)可能會(huì)使細(xì)胞有所損傷導(dǎo)致后期產(chǎn)生骨細(xì)胞量少，但融合度一定不能低于70%。

② 換誘導(dǎo)培養(yǎng)基的頻率大致保持在3天一次，如果期間細(xì)胞產(chǎn)生的排泄物導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)雜質(zhì)多便可以馬上換液，不可以過度延長(zhǎng)換液時(shí)間，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

③ 為了減少誘導(dǎo)過程中細(xì)胞飄起、不貼壁，鋪板前可先鋪明膠包被細(xì)胞板底部，換液時(shí)盡量輕輕加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不要將細(xì)胞吹起，導(dǎo)致細(xì)胞脫落。

3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)模型

1. 實(shí)驗(yàn)背景

細(xì)胞生物學(xué)方面，前脂肪細(xì)胞是一類同時(shí)具有增殖及分化為成熟脂肪細(xì)胞能力的前體細(xì)胞，此種前體細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)因子、激素等的作用下,經(jīng)歷有絲分裂克隆期、生長(zhǎng)停滯期、進(jìn)一步的克隆期 終末分化四個(gè)階段，細(xì)胞本身的成纖維狀態(tài)發(fā)生改變，通過胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯聚集形成成熟脂肪細(xì)胞，這一過程，稱為“成脂分化”，該過程一直是肥胖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

為了能夠直觀地了解細(xì)胞分化內(nèi)部脂質(zhì)累積的過程，需要在體外建立數(shù)量可控，分化較為穩(wěn)定的成熟脂肪細(xì)胞分化模型。3T3-L1細(xì)胞 (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)是通過克隆分離得到的3T3(swiss小白鼠)的連續(xù)亞株。當(dāng)3T3-L1細(xì)胞從快速分裂到長(zhǎng)滿且接觸抑制時(shí)，3T3-L1細(xì)胞在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下前脂肪可向脂肪樣逆轉(zhuǎn)。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

① 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：3T3-L1細(xì)胞。

② 器械：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡、臺(tái)式低速離心機(jī)。

③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、3T3-L1細(xì)胞專用培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

① 加1ml 0.1%明膠到六孔板中，搖勻，使其能覆蓋各孔底面。

② 將鋪有0.1%明膠的六孔板放置在超凈臺(tái)或CO2培養(yǎng)箱至少30min。

③ 30min后吸去明膠即可用于接種細(xì)胞；

④ 將細(xì)胞接種于六孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

⑤ 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時(shí)，小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2ml OriCell?小鼠細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液。

⑥ 誘導(dǎo)3天后，吸去A液，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。

⑦ 維持1天后，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)。

⑧ A液和B液交替使用。

⑨ 重復(fù)誘導(dǎo)和維持過程，直到出現(xiàn)足量、大小適宜的脂滴，即可油紅O染色。

4. 評(píng)價(jià)方法

油紅O脂肪染色法是指在日常病理診斷和科研工作中為了顯示組織或細(xì)胞內(nèi)的脂肪常采用油紅O進(jìn)行染色的方法，油紅O為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織或細(xì)胞內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色?？蓪⒂椭境杉t色，顯微鏡下觀察染色情況即可評(píng)估細(xì)胞的成脂性。   

5. 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

① 油紅O染色后盡快拍照，或者用封口膜封裝后置于4℃，不要超過一周，油脂會(huì)相互融合，無法保持染色時(shí)的狀態(tài)。

② A液刺激脂滴形成，B液維持已形成的脂滴，并促進(jìn)脂滴增大。通常情況下按照“A液3天，B液1天”的使用方法，也可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)靈活調(diào)整A液、B液的使用比例。

③ 為了減少誘導(dǎo)過程中細(xì)胞飄起、不貼壁，鋪板前先鋪明膠包被細(xì)胞板底部，誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)也有可能出現(xiàn)細(xì)胞層卷邊情況，若已有足量、大小合適的脂滴，即可染色收集。

乳鼠二型肺泡上皮細(xì)胞(AECII)分離提取

1. 細(xì)胞簡(jiǎn)介

二型肺泡細(xì)胞(ATⅡ)又稱顆粒肺泡細(xì)胞，散在分布于ATⅠ肺泡細(xì)胞(ATⅠ)之間及其相鄰的肺泡間隔結(jié)合處。其體積較小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)染色較淺淡，胞質(zhì)中常見空泡。數(shù)量較ATⅠ多，ATⅡ占肺泡上皮細(xì)胞總數(shù)的14%到16%，但僅覆蓋5℅的肺泡表面。二型肺泡細(xì)胞能分泌顆粒內(nèi)容，在肺泡上皮表面形成表面活性物質(zhì)，具有降低肺泡表面張力，穩(wěn)定肺泡大小的重要作用。

2. 原代分離提取步驟

① 將乳鼠移入超凈臺(tái)，從胸部橫斷乳鼠，小心取出雙肺置于預(yù)冷的PBS液中，盡可能除凈殘留的氣管組織和結(jié)締組織等非肺組織，PBS液清洗2~3次，用鋒利眼科剪將肺組織剪為1mm3 左右大小的組織碎塊，用0.25%胰酶（含0.01% DnaseⅠ）溶液清洗1次，然后繼續(xù)用0.25%胰酶（含0.01% DnaseⅠ）溶液于37℃攪動(dòng)消化10~20min。

② 用等量10%FBS的DMEM/F12（完全培養(yǎng)基）終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后，1500r/min低溫離心５min，去上清，收集沉淀，0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃，5% CO2 孵箱內(nèi)消化10~20min。
終止消化仍用等量含10%FBS的DMEM/F12，1000r/min離心5min，收集細(xì)胞沉淀。

③ 將細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶中，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45min，此時(shí)貼壁的細(xì)胞多為成纖維細(xì)胞，懸在培養(yǎng)液中的細(xì)胞多數(shù)為AECⅡ、部分成纖維細(xì)胞及其他雜細(xì)胞。

④ 將培養(yǎng)液吸出接種于另一培養(yǎng)瓶中，同樣繼續(xù)37℃孵育40min，連續(xù)2~3次，最后吸出培養(yǎng)液，800r/min離 心5min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細(xì)胞沉淀，按密度為4*105個(gè)細(xì)胞／cm2 接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24h后換液，去除未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3~6d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征。培養(yǎng)48h細(xì)胞狀態(tài)良好，可進(jìn)行進(jìn)一步的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. 乳鼠二型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）質(zhì)量評(píng)價(jià)

① 臺(tái)盼藍(lán)染色法

活細(xì)胞計(jì)數(shù)：臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率（活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

② AECⅡ形態(tài)特征觀察

體外原代培養(yǎng)的AECⅡ約18h已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)。

培養(yǎng)24h，細(xì)胞伸展呈多邊形或立方形，聚集成島狀生長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接緊密，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，內(nèi)含大量反差明顯的細(xì)小顆粒（圖1）。

培養(yǎng)36~48h，細(xì)胞平展呈多邊形，逐漸融合，相互連接成細(xì)胞單層。培養(yǎng)大約72h后，細(xì)胞逐漸變得扁平，細(xì)胞內(nèi)顆粒較前減少，有排空現(xiàn)象，胞質(zhì)顏色變淡（圖2）。

③ 透射電鏡觀察

細(xì)胞消化后，離心，收集細(xì)胞沉淀。經(jīng)戊二醛固定處理程序后，制成電鏡細(xì)胞標(biāo)本，用電鏡觀察細(xì)胞特征性的超微結(jié)構(gòu)，可見黑色顆粒狀特征性的板層體，細(xì)胞膜上有明顯的微絨毛。

④ 純度鑒定

經(jīng)SP-C免疫熒光鑒定細(xì)胞純度。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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